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IF=20.4 高分ac4C新鲜出炉||云序助力客户探究ac4C与肿瘤和免疫相关新机制

发布时间:2024-06-27 09:06 |  点击次数:

类风湿性关节炎(RA)是一种慢性自身免疫性疾病,其特征是持续性滑膜炎症以及软骨和骨骼破坏。近日,云序生物助力中山大学附属第一医院许韩师和肖游君团队通过acRIP-seq & RNA-seq等多种方法结合成功在BMJ旗下Annals of the Rheumatic Diseases期刊上在线发表文章《NAT10 promotes synovial aggression by increasing the stability and translation of N4-acetylated PTX3 mRNA in rheumatoid arthritis》,首次探究了类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)成纤维样滑膜细胞中乙酰基转移酶10(NAT10)介导的N4-乙酰胞嘧啶(N4-acetylcytidine, ac4C)修饰作用,共同阐明了NAT10介导的PTX3 mRNA的ac4C修饰是调控滑膜侵袭和炎症的新机制,同时也为类风湿关节炎治疗提供了潜在的治疗靶点。

云序生物有幸为该研究提供了ac4C RNA修饰测序及转录组测序及生信分析服务,同时本研究中涉及的验证服务云序生物也都可提供,欢迎老师们线下线上咨询。现在就让小编为老师们分享下这篇文章的主要内容吧!

 

标题:NAT10 promotes synovial aggression by increasing the stability and translation of N4-acetylated PTX3 mRNA in rheumatoid arthritis

发表时间:2024.5.8

发表期刊:Annals of the Rheumatic Diseases

影响因子:20.3

样品类型:人滑膜细胞(3 vs 3)

研究方法:acRIP-seq &RNA-seq & acRIP-qPCR & RIP-qPCR

 

研究摘要

 

近年来的研究发现,Nacetyltransferase 10(NAT10)介导的ac4C修饰在炎症和免疫浸润中起着独特的作用。本研究作者首先从已确诊的RA患者中提取FLSs,验证NAT10基因及蛋白的表达并检测整体修饰水平。同时,利用acRIP-seq & RNA-seq联合分析鉴定出NAT10的潜在靶点,采用RIP-qPCR实验验证NAT10与靶基因mRNA的相互作用。结果发现RA患者FLSs和滑膜中NAT10和ac4C水平升高,NAT10敲除或特异性抑制剂治疗可减少RA FLSs的迁移和侵袭,且滑膜内NAT10水平升高与滑膜内多种免疫细胞浸润呈正相关。体内抑制NAT10可减轻CIA和DTHA小鼠以及CIA大鼠关节炎的严重程度。机制上,NAT10通过促进乙酰化PTX3 mRNA的稳定性和翻译效率来调节RA FLS侵袭和功能。最终揭示NAT10介导的ac4C修饰在促进类风湿滑膜侵袭和炎症中的重要作用,表明NAT10可能是治疗RA甚至其他FLSs失调相关疾病的潜在靶点。

 

技术路线

图片2

 

研究结果

 

1、NAT10介导的ac4C修饰在类风湿性关节炎(RA)患者的成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)和滑膜组织中升高

与健康对照组(HC FLS)相比,RA FLS中NAT10的转录本水平和蛋白表达水平均升高,LC/MS整体水平检测发现ac4C的整体水平升高。NAT10敲低或Remodelin(胞苷乙酰转移酶蛋白 NAT10 的假定小分子抑制剂)处理也能降低RA FLS中ac4C的整体修饰水平。同时,与HC相比,RA滑膜组织中NAT10的表达增加,且NAT10的表达与RA患者的28个关节疾病活动评分-红细胞沉降率 (ESR) 评分之间存在显著相关性。最终结果表明NAT10介导的ac4C可能参与了RA的发病机制。

 

 

2、NAT10调节RA FLS的迁移和侵袭且其在RA FLS中的表达升高与免疫细胞浸润有关

通过构建NAT10敲低及过表达的细胞系,发现NAT10敲低降低了RA FLS的迁移和侵袭,过表达NAT10促进了RA FLS的迁移和侵袭。同时,Remodelin处理可抑制NAT10的表达,减少RA FLS的迁移和侵袭和RA FLS 中的板状伪足形成,但不影响细胞活力和RA FLS的增殖和凋亡。这些结果说明NAT10参与调节RA FLS的侵袭性行为,但不参与增殖、凋亡或细胞因子和MMP的表达。同时,与shNAT10 RA FLS组相比,NAT10过表达的RA FLS中,树突状细胞(DC)、T细胞和B细胞的浸润显著增加。这表明NAT10在RA FLS中的表达与滑膜免疫细胞浸润有关。

 

3、PTX3是RA FLS中NAT10的ac4C修饰靶点

为了研究NAT10调节RA FLS功能的潜在机制,作者对带有shNAT10和shNC的RA FLS分别进行acRIP-seq和RNA-seq结果发现shNAT10组有565个低乙酰化峰和442个高乙酰化峰(|log2FC|≥1),ac4C修饰峰主要位于mRNA转录本的蛋白质编码区(CDS),且在富含C的序列中高度富集。同时,RNA-seq显示在NAT10敲低后,547个基因下调,591个基因上调(|log2FC|≥1)。进一步分析发现,少数差异低乙酰化基因显著富集在细胞骨架组织等通路中,许多表达差异下调基因与趋化性有关。尽管NAT10对细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、CCL2、MMP1、MMP2、MMP-3和MMP-9的影响很小,但作者推测它可以通过影响其他趋化因子(如CCR7、CXCR1、CXCL5和CXCL14)增强RA FLS的趋化能力。结果表明,暴露于NAT10可以调节与迁移和侵袭相关的少数基因,这表明NAT10对于RA FLS和免疫细胞的迁移至关重要。

 

为了确定NAT10调控的下游主要靶基因,筛选出NAT10敲低后乙酰化修饰降低且基因表达水平降低的基因,并通过acRIP-qPCR验证了前5个基因(IL-26、STC2、PTX3、ALDHIL2 和 SYNE2)。结果发现敲除NAT10后,5个基因的修饰均显著下调,但在RA FLS中,只有PTX3的表达存在显著差异,IL-26、STC2、ALDHIL2和SYNE2的表达则没有差异。同时进一步分析发现,NAT10的敲低导致PTX3的CDS和5'UTR上的乙酰化峰显著降低。先前研究报道,PTX3在血清和滑膜样本中的水平均升高,且与RA严重程度和免疫细胞浸润呈正相关。因此,作者推测NAT10通过乙酰化PTX3 mRNA来调节RA FLS的侵袭性行为。

 

除此之外,实验还观察到NAT10敲除后,PTX3的mRNA和蛋白质表达水平持续下降,PTX3的CDS和5'UTR乙酰化降低。进一步通过荧光素酶报告基因检测发下NAT10抑制显著降低了WT PTX3报告基因的荧光素酶活性,但对shNC RA FLS中的Mut1和Mut2报告基因没有影响,这表明NAT10依赖于PTX3 mRNA CDS和5`UTR的ac4C修饰,直接调节PTX3的表达。同时,还发现PTX3 CDS和5'UTR的ac4C修饰还影响RA FLS中PTX3 mRNA的翻译效率。对RA FLS的NAT10 RIP-qPCR结果表明,NAT10可以与RA FLS中的PTX3 mRNA结合,NAT10敲除组中NAT10与PTX3 mRNA的结合显著降低。因此,研究结果表明NAT10介导的ac4C乙酰化修饰通过影响mRNA稳定性和翻译效率来调节PTX3表达。

 

 

4、PTX3在调节RA FLS迁移和侵袭以及免疫细胞滑膜浸润中的作用

PTX3基因在RA FLS和HC FLS均表达,但与HC FLS相比,RA FLS中PTX3 mRNA和蛋白质的表达增加。与HC受试者相比,RA患者滑膜组织中的PTX3水平也明显升高。另外,作者还构建了PTX3敲低或过表达体系来探究其对RA FLS迁移和侵袭的影响。结果发现,PTX3敲低抑制了细胞迁移和侵袭,还导致板状伪足形成受到抑制。PTX3过表达显著逆转了NAT10敲除对细胞迁移和侵袭的影响,表明PTX3介导NAT10诱导的RA FLS侵袭行为。之前的研究已经表明PTX3存在于RA患者的滑液和血清中,因此作者推测NAT10可能控制RA FLS分泌PTX3。NAT10敲低降低了培养的RA FLS中PTX3的表达。进一步发现,用重组人PTX3治疗可促进RA FLS的迁移和侵袭。这些结果表明,NAT10诱导的PTX3分泌以自分泌方式促进RA FLS的迁移和侵袭。最后,作者估计了PTX3敲除及过表达RA FLS组之间的免疫细胞比例,发现在PTX3高表达组中,DCs、T细胞和B细胞的浸润显著增加。在RA患者的滑膜PDPN+FLS中,NAT10水平与PTX3呈正相关。

 

5、NAT10抑制可减轻RA模型中的关节炎的严重程度

通过建立两种RA动物模型,即胶原Ⅱ型诱发性关节炎(CIA)大鼠或小鼠和迟发型超敏性关节炎(DTHA)小鼠,作者评估了NAT10敲除对关节炎进展的影响。结果发现,与对照组相比,NAT10的敲除降低关节炎的评分、后爪体积和踝关节周长,骨破坏较少,且骨表面与骨体积(BS/BV)比值较低。NAT10的敲除还减少了关节内的滑膜增生以及软骨和骨质破坏,在局部关节内敲低NAT10后,CIA大鼠滑膜组织中NAT10和PTX3的表达降低。同时,口服Remodelin的小鼠的关节炎评分低于对照组,Remodelin处理还减少了滑膜炎症、增生、骨质侵蚀和软骨破坏。此外,Remodelin处理组与对照组之间肝脏和肾脏组织均未发现显著的组织病理学变化,提示Remodelin治疗的安全性。进一步观察发现,Remodelin治疗组滑膜组织中PTX3的表达低于对照组。最后,作者还利用NAT10杂合缺失小鼠(NAT10+/mice)构建了DTHA关节炎模型。结果发现,与WT小鼠相比,NAT10+/-小鼠的爪肿胀程度和关节炎评分降低。与WT小鼠相比,NAT10+/-小鼠的滑膜炎症、增生、骨侵蚀和软骨破坏均有显著改善。有趣的是,DTHA模型中NAT10+/-小鼠滑膜组织中浸润的CD3+T细胞、CD19+B细胞和CD11c+DC比WT小鼠少,NAT10+/-小鼠滑膜组织中 PTX3表达低于WT小鼠。

 

 

全文小结

 

NAT10介导的ac4C修饰在类风湿性关节炎(RA)患者的成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)和滑膜组织中升高

NAT10调节RA FLS的迁移和侵袭且其在RA FLS中的表达升高与免疫细胞浸润有关

PTX3是RA FLS中NAT10的ac4C修饰靶点,NAT10介导的ac4C乙酰化修饰通过影响mRNA稳定性和翻译效率来调节PTX3表达。NAT10通过乙酰化PTX3 mRNA来调节RA FLS的侵袭性行为

PTX3在调节RA FLS迁移和侵袭以及免疫细胞滑膜浸润中的作用

NAT10抑制可减轻RA模型中的关节炎的严重程度

云序生物ac4C修饰研究四大模块

1、ac4C RNA修饰测序

ac4C RNA修饰单碱基测序(RedaC:T-seq)

RedaC:T-seq可以实现ac4C RNA乙酰化修饰的单碱基分辨检测。通过NaBH4处理,将ac4C还原为四氢ac4C,但不影响未发生修饰的胞苷,在逆转录时,经过NaBH4处理后形成的四氢ac4C可以与T配对,未发生修饰的胞苷仍然与G配对,通过对比两组样本的测序结果,可以将RNA乙酰化修饰位点单碱基定位到转录组上,还可根据RNA-seq数据,计算样本中RNA乙酰化程度及对RNA表达水平的影响。

ac4C RNA修饰测序(acRIP-seq)

对ac4C RNA乙酰化,目前流行的检测手段为acRIP-seq技术,适用于ac4C RNA乙酰化谱研究,快速筛选ac4C RNA乙酰化靶基因。云序可提供mRNA和多种非编码RNA的修饰测序:

ac4C 全转录组测序(涵盖mRNA,LncRNA,circRNA)

ac4C  LncRNA测序(涵盖LncRNA和mRNA)

ac4C  Pri-miRNA测序(涵盖Pri-miRNA和mRNA)

ac4C  mRNA测序

ac4C  miRNA测序

 

2、ac4C RNA修饰上游酶的筛选

ac4C RNA修饰相关酶PCR芯片

寻找上游直接调控ac4C RNA乙酰化的酶。

 

3、ac4C RNA修饰靶基因验证

MeRIP-qPCR/GenSeq® MeRIP试剂盒

云序提供各类不同修饰的MeRIP-qPCR服务以及销售GenSeq® MeRIP试剂盒,可针对mRNA,lncRNA,环状RNA等不同类型的RNA分子进行检测,低通量验证RNA修饰靶基因表达水平。

 

4、机制互作研究

RIP-seq/qPCR/GenSeq® RIP试剂盒

筛选或验证RNA修饰直接靶点,研究RNA修饰靶基因的调控机制。

RNA pull down -MS/WB

筛选或验证目标RNA互作基因或蛋白,研究相应的分子调控机制。

ChIP-seq

筛选或验证目标蛋白与DNA互作,研究相应的分子调控机制。

Ribo-seq

筛选翻译水平发生变化的RNA分子,研究相应的分子调控机制。

SLAM-seq

筛选稳定性发生变化的RNA分子,研究相应的分子调控机制。

CHIRP-seq

筛选或验证目标RNA与DNA互作,研究相应的分子机制。

 

云序生物服务优势

 

优势一:云序累计支持客户发表数百篇SCI论文,合计影响因子3000 +

优势二:累计完成测序样本数万例,全面覆盖医口、农口等各类样本

优势三:全面检测mRNA和各类非编码RNA(circRNA,lncRNA,Pri-miRNA等)

优势四:提供RNA修饰一站式服务:整体水平检测、RNA修饰研究、MeRIP-qPCR验证、RIP-seq、RNA pull-down、Ribo-seq和SLAM-seq等

优势五:率先研发超微量MeRIP测序技术,RNA量低至500ng起

优势六:国内较全的RNA修饰测序平台,提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙酰化和2'-O-甲基化、假尿嘧啶等修饰的测序技术

 

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