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Get新热点! m6A&单细胞强强联合,助力文章升级! | m6A&单细胞专题一

发布时间:2024-06-12 13:58 |  点击次数:

m6A(N6-甲基腺嘌呤)是RNA上最常见的一种化学修饰,它参与调控多种生物学过程,包括基因表达、RNA稳定性和翻译效率等。调控m6A蛋白的失调可以驱动靶转录本的异常转录、加工和翻译,从而影响各种疾病,特别是癌症的发生、发展和预后。

m6A 调控蛋白与疾病
Liu, Y., et al. 2023. Trends in molecular medicine

但目前的Bulk RNA-seq测序技术以大量细胞/RNA为起始材料,通过所有细胞的平均基因表达进行后续研究,细胞异质性被掩盖。而单细胞测序技术则能够在单个细胞水平上分析基因表达,揭示细胞的异质性和复杂性。

 

m6A修饰&单细胞测序

m6A修饰和单细胞测序,它们各自提供了独特的信息,并且可以相互补充。m6A修饰分析可以揭示RNA分子的修饰状态,而单细胞测序则可以揭示具体细胞类型的基因表达状态。通过联合分析,可以定位到具体细胞类群,锁定关键调控因子,从而更精确地理解细胞的功能和状态。此外,这种联合分析还有助于揭示细胞间的异质性,尤其是在复杂的组织或疾病样本中。例如,在肿瘤微环境中,不同类型的细胞可能具有不同的m6A修饰模式,这些模式可能与其在肿瘤发展中的角色有关。通过单细胞测序,可以识别这些细胞类型,并通过m6A修饰分析了解它们的功能差异。

联合分析优势

  • 探索m6A修饰的细胞特异性:m6A修饰在不同类型的细胞或同一类型细胞的不同状态下可能存在差异,通过单细胞测序可联合探究m6A修饰调节的关键细胞类群。
  • 研究m6A与基因表达的关联:通过对m6A修饰调控蛋白的过表达或敲除,与单细胞转录组数据联合分析,可更精确地了解m6A如何影响基因表达和细胞功能。
  • 揭示m6A在细胞命运决定中的作用:与单细胞数据联合分析,有助于理解m6A修饰在细胞分化、发育和疾病进展中的角色。
  • 识别关键调控因子:联合分析可以帮助识别那些受m6A修饰调控的关键基因和转录本,从而深入理解特定生物学过程的分子机制。

 

m6A&单细胞测序研究思路

m6A与单细胞测序如何联合分析呢?前期思路基本与常规RNA修饰一致,通过PCR芯片或数据库等手段筛选RNA修饰调控蛋白,通过敲除/过表达验证细胞表型,确定其调控疾病发生、发展。后续利用scRNA-seq、m6A MeRIP-seq等技术手段锁定关键细胞类群及关键靶基因,更加深入探究其分子作用机制。

 

云序客户案例

文章链接:RNA m6A methylation orchestrates cancer growth and metastasis via macrophage reprogramming

 

研究摘要

m6A是一种可逆的mRNA修饰,已被证明在各种生物过程中发挥重要作用。然而,m6A修饰在巨噬细胞中的作用仍然未知。作者通过scRNA-seq、m6A MeRIP-seq等技术发现骨髓细胞中Mettl3的消融促进了体内肿瘤的生长和转移。与野生型小鼠相比,Mettl3缺陷小鼠表现出M1/M2样肿瘤相关巨噬细胞的增加,并且调节性T细胞浸润到肿瘤中。m6A MeRIP-seq发现METTL3的缺失会损害YTHDF1介导的SPRED2翻译,从而通过ERK通路增强NF-kB和STAT3的激活,导致肿瘤生长和转移增加。此外,PD-1检查点阻断的治疗效果在Mettl3缺陷小鼠中减弱,将METTL3确定为肿瘤免疫治疗的潜在治疗靶点。

 

技术路线

 

 

研究结果

1、骨髓特异性的Mettl3缺失促进肿瘤生长和转移

为了研究m6A修饰在巨噬细胞中的作用,作者将WT BMDMs(骨髓源性巨噬细胞)与B16细胞共孵育,发现Mettl3的表达显著减少。为了研究骨髓细胞中的Mettl3是否能够调节肿瘤的进程。作者将Mettl3fl/fl小鼠与Lyz-cre小鼠杂交敲除了髓腔室中的Mettl3。然后,对Mettl3fl/flLyz2+/+ (WT)和Mettl3fl/flLyz2cre/+ (KO)小鼠的BMDMs和腹腔巨噬细胞(PMs)进行qRT-PCR和western blotting检测。结果表明,来自KO小鼠的BMDMs和BM中Mettl3 mRNA表达分别下降了约75%和80%。此外,KO BMDMs中mRNA上m6A修饰水平低于WT。作者将B16或LLC细胞皮下注射到WT或KO小鼠中,KO小鼠的肿瘤生长速度明显快于WT小鼠,这些敲除Mettl3小鼠的生存时间缩短(图1a-d)。通过尾静脉将B16或LLC细胞注射到小鼠体内,生物发光成像显示,与WT小鼠相比,KO小鼠的肺转移增强(图1e, f)。组织学检查显示,与WT小鼠相比,KO小鼠有更大、更多的肺转移结节且Ki67染色增加(图1g-j),导致KO小鼠比WT小鼠总生存时间缩短(图1k)。此外,与正常组织中的巨噬细胞相比,TAMs中Mettl3的表达减弱(图1 l)。上述结果说明Mettl3在骨髓细胞中的缺失会导致肿瘤的生长和增殖。

 

 

为了探讨BMDMs中Mettl3的缺失是否会促进肿瘤生长,作者建立了巨噬细胞和肿瘤细胞的混合模型。用CFSE标记BMDMs,并将B16或LLC细胞共注入小鼠皮下F4/80免疫荧光染色结果显示CFSE标记的细胞共注射BMDMs可在肿瘤中存活2周。进一步的分析表明,B16或LLC细胞与KO BMDMs共注射可显著加速肿瘤的生长(图2a-f)。接下来,在实验前两天通过静脉注射氯膦suan脂质体来减少小鼠的巨噬细胞,然后将B16细胞静脉注射到小鼠体内,生物发光成像显示,巨噬细胞耗竭消除了WT和KO小鼠肿瘤生长和转移的差异(图2g, h),并通过肺肿瘤组织学分析证实了这一点(图2i, j)。消耗了巨噬细胞的小鼠的生存期得到延长,用氯膦suan脂质体处理的WT和KO小鼠之间没有显著差异(图2k)。综上所述,巨噬细胞中METTL3在促进肿瘤进展中发挥重要作用。

 

 

2、巨噬细胞中Mettl3的缺失通过增强M1-和M2-like TAM和Treg对肿瘤的浸润来重塑肿瘤微环境

为了评估Mettl3对免疫微环境的影响,采用流式细胞术对脾和肺进行免疫表型分型,发现KO小鼠的M1巨噬细胞, M2巨噬细胞和调节性T细胞的总体百分比增加。为了进一步研究Mettl3对肿瘤微环境的影响,通过scRNA-seq分析了WT或KO小鼠肿瘤中的CD45+细胞。KO小鼠的肿瘤与WT小鼠的肿瘤在免疫细胞的组成上存在差异,包括TAMs、MDSCs和CD4+的数量增加,T细胞以及粒细胞和CD8+ T细胞数量减少的趋势。此外,通过流式细胞术对含有mettl3-缺陷巨噬细胞的肿瘤组织进行免疫表型分析,发现M1-和M2-like TAMs总体百分比增加(图3a)。此外,MDSCs和调节性T细胞的数量有增加的趋势(图3b-d)。先前的研究表明,Treg在各种肿瘤组织中的迁移和浸润似乎依赖于肿瘤细胞或浸润巨噬细胞产生的CCR4配体(CCL22)的表达。通过qRT-PCR和ELISA检测发现,在mettl3缺失的BMDMs和TAMs中,CCL22表达显著上调(图3e, f)。作者研究了注射抗CD25抗体对Treg水平的影响,发现Treg水平有75%的下降。随着Treg细胞数量的减少,Th1细胞和IFN-γ+ CD8 T细胞在肿瘤细胞中增加,而Th2细胞基本未受影响。进一步分析表明WT和接受抗CD25抗Treg消除抗体的KO小鼠在肿瘤生长或转移方面没有显著差异,但与WT小鼠相比,在未处理组,KO小鼠的肿瘤生长增加(图3g-k)。去掉Treg后,WT和KO小鼠的存活率差异也消失了(图3l)。这些数据表明髓系细胞中Mettl3的缺失促进了肿瘤的生长和转移,其方式依赖于M1/M2-like TAM浸润和Treg募集。

 

 

3、Mettl3敲除通过NF-kB / STAT3轴促进BMDMs中M1和M2极化

为了研究Mettl3在巨噬细胞极化中的潜在作用,使用LPS和IFN-γ诱导M1巨噬细胞或IL-4诱导M2巨噬细胞。qRT-PCR检测了M1和M2巨噬细胞相关基因的表达,发现在mettl3缺失的BMDMs中TNF-α、IL-6和Arg1的表达明显上调(图4a)。ELISA还发现Mettl3缺失的BMDMs中TNF-α和IL-6表达上调,IL-10表达相对不变(图4 b)。在Mettl3缺失的BMDMs中也观察到精氨酸酶活性的增加(图4c)。在BMDMs中评估了p65,观察到p65和STAT3磷酸化水平在mettl3缺失的巨噬细胞中升高(图4d)。NF-κB的抑制降低了TNF-α、IL-6和Arg1,而抑制STAT3通路降低了WT和KO BMDMs中Arg1的表达(图4 e)。芯片分析表明p-STAT3特异性结合到Arg1的启动子上(图4f)。接下来从携带肿瘤的小鼠中收获并用流式细胞术检测TAMs结果显示,KO TAMs中M1和M2巨噬细胞相关基因表达同时增加,这与p65和STAT3磷酸化和ARG1表达增强有关(图4g-i)。综上所述,这些数据表明Mettl3的缺失导致NF-κB通路和STAT3信号通路的激活,从而导致M1和M2-like巨噬细胞极化。

 

 

4、肿瘤细胞增强细胞因子的产生,并在mettl3敲降巨噬细胞中激活NF-κB和STAT3

由于NF-κB和STAT3可受细胞外源性因子TNF-α或IL-6刺激BMDMs调节。免疫印迹结果显示,KO BMDMs诱导p-p65和p-STAT3的能力比WT更明显。qRT-PCR分析显示TNF-α处理后TNF-α和IL-6的表达增加,通过bay11-7082阻断NF-κB通路后逆转,而IL-6作用后,Arg1的表达增加,通过STAT3抑制剂S3I-201处理后逆转。这些结果提示,NF-κB/IL-6/STAT3信号轴在KO BMDMs中比WT BMDMs更活跃。

为了评估NF-κB/IL-6/STAT3信号轴在肿瘤微环境中的作用,将B16或LLC细胞与BMDMs孵育,发现IL-6在B16和LLC细胞中表达上调,p65磷酸化水平增加,并通过bay11 -7082阻断NF-κB通路后逆转(图5a)。进一步发现TNF-α治疗不仅增加了p65的磷酸化也增加IL-6的表达,用NF -κB抑制剂处理可逆转肿瘤细胞中IL-6的表达(图5b)。此外,WT或KO BMDMs用bay11 -7082或抗TNF-α抗体前处理然后与B16或LLC细胞共培养。qRT-PCR分析显示,bbay11 -7082或抗TNF-α抗体的加入抑制了IL-6的表达(图5c),伴随p65和STAT3磷酸化降低(图5 d)。此外,在mettl3缺失的BMDMs与B16或LLC细胞共培养时,与WT BMDMs相比,Arg1的表达显著降低(图5e, f)。总之,这些数据表明,mettl3缺失的巨噬细胞通过调节细胞因子反应重塑了肿瘤微环境。

 

 

5、METTL3的缺失会损害YTHDF1介导的SPRED2翻译

探讨m6A在巨噬细胞重编程中的作用,对WT和KO BMDMs进行了m6A MeRIP-seq,生信分析得到了m6A峰密度图(图6a),Motif分析发现了m6A修饰的保守Motif“GGAC”(图6b)。为确定m6a调控的巨噬细胞极化潜在的目标基因,作者在MAPK通路相关基因和70个m6A下调基因中取交集获得候选基因。在这些基因中,Spred2上m6A水平显著降低(图6c, d)。此外,m6A MeRIP-qPCR证实Spred2是m6A调控的靶基因(图6e)。随后在KO BMDMs和TAMs中发现,SPRED2蛋白表达降低,而mRNA水平没有明显改变(图6f)。mRNA衰减实验表明,m6A修饰对Spred2的衰减没有明显影响(图6g)。因此推测在Mettl3缺失的BMDMs中,SPRED2蛋白表达的下调可能是由于YTHDF1控制的蛋白质翻译效率的差异所致。

然后作者通过多聚体分析WT和KO BMDMs将RNA分成非翻译部分,翻译起始部分和翻译活性多聚体(图6h)。qRT-PCR结果显示,mettl3缺失的BMDMs翻译活性多聚体中Spred2 mRNA水平显著低于WT BMDMs(图6i)。然后检测了METTL3是否被招募到Spred2启动子中并影响Spred2的表达,结果表明野生型METTL3 和催化死亡突变体METTL3可影响荧光素酶活性。为了研究CDS中m6A甲基化是否能调控SPRED2的表达,将m6A修饰保守位点GGAC突变为GCTC (SPRED2 -CDS mut1或SPRED2 -CDS mut2)或同时突变(SPRED2 -CDS mut1/2)。其中Spred2-CDS mut2和Spred2-CDS mut1/2降低了SPRED2水平而Spred2-CDS mut1没有,这表明Spred2-CDS mut2中的m6A基序是表达调控的主要位点(图6j, k)。此外,RNA-IP结果显示,YTHDF1和Spred2在Mettl3 KO植株中互作下降。为了证实YTHDF1在m6a调控SPRED2表达中的作用,在BMDMs中下调了YTHDF1的表达。YTHDF1基因敲除显著减弱SPRED2在BMDMs中的表达,增加了ERK, NF-κB和STAT3磷酸化。qRT-PCR分析显示,YTHDF1敲除后Tnf-α、Il-6、Arg1和Ccl22的表达增加。此外,BMDMs中SPRED2的下调导致ERK、NF-κB和STAT3磷酸化上调,并伴有Tnf-α, Il-6, Arg1和Ccl22上调表达。总的来说,BMDMs中Mettl3的丢失导致BMDMs中ythdf1介导的SPRED2的翻译和ERK, NF-κB和STAT3磷酸化。

 

 

6、髓系细胞中Mettl3的缺失会损害PD-1阻断治疗B16黑色素瘤的疗效

为了评估靶向METTL3激活抗肿瘤反应的潜力,在B16肿瘤转移模型中测试了抗PD-1治疗。正如预期的那样发现在KO小鼠中,B16肿瘤对抗pd -1治疗的反应较低,这大大增加了肿瘤生长和肺转移,缩短了生存时间(图7a-f)。说明Mettl3缺乏的髓系细胞参与了B16肿瘤对抗PD-1治疗产生耐药性。

 

 

 

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