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新品上市|| R-Loop检测技术强势来袭!!!

发布时间:2024-05-16 14:02 |  点击次数:

随着表观转录组学的蓬勃开展,R-Loop这个小众话题逐渐成为一个新的研究热点。1976年,Thomas等首次通过电子显微镜观察到了R-loop结构,又称R环,是含有DNA-RNA双链和被置换的DNA单链组成的特殊三链核酸结构。后来的研究表明RNA-DNA杂合链是在转录、DNA复制和DNA修复过程中产生的至关重要的中间产物。R-loop广泛存在于基因组中,多数集中在转录起始区域和转录终止区域。在调节基因表达DNA复制以及DNA和组蛋白修饰方面发挥着重要作用,具有多种生物学功能。

云序生物推出高灵敏R-Loop测序服务,DRIPc-Seq &ssDRIP-Seq基于S9.6抗体免疫沉淀,实现全基因组范围内进行R-Loop结构的DNA 或 RNA的检测,并具有高分辨、高灵敏、高特异性的特点。适用于肿瘤、免疫、神经和发育、植物生长和代谢等生命科学和精准医学领域的研究。

DRIPc-Seq测序技术

DRIPc技术简介:

DRIPc-Seq(DNA:RNA immunoprecipitation followed by cDNA conversion coupled to high throughput sequencing)是一种基于抗体富集,RNA反转录链建库的“DNA:RNA杂合链免疫共沉淀及高通量测序技术”,利用针对R-Loop结构中的RNA链反转录进行建库测序,能够在全基因组范围内检测R-Loop结构中的RNA链;针对长链mRNA、LncRNA及circRNA的链特异性检测。

DRIPc技术流程:

DRIPc技术优势:

在全基因组范围内检测R-Loop结构中的RNA链

针对长链mRNA、LncRNA及circRNA的链特异性检测

ssDRIP-Seq测序技术

ssDRIP技术简介:

ssDRIP (single-strand DNA ligation-based library construction of DNA:RNA hybrid immunoprecipitation and sequencing)是一种基于抗体富集,单链DNA建库的“DNA:RNA杂合链免疫共沉淀及高通量测序技术”利用针对R-Loop结构中的ssDNA链建库测序,能够在全基因组范围内检测R-Loop结构中的DNA链,设置RNase H文库,确保建库DNA非基因组DNA。

ssDRIP技术流程:

ssDRIP云序优势:

在全基因组范围内检测R-Loop结构中的DNA链

RNase H文库,排除基因组DNA的干扰

链特异性的检测

案例解读一:R环与免疫应答

主题:源于 R 环的细胞质 RNA-DNA 杂交体能激活免疫反应

原文:R-loop-derived cytoplasmic RNA–DNA hybrids activate an immune response

期刊:Nature             影响因子:64.8             发表时间:2022.12.21

 

​loop在转录过程中形成的三链核酸结构,计划外的R-loop会干扰DNA复制和转录,并与多种疾病状态中双链断裂、基因组不稳定、衰老和细胞死亡等有关。为了研究R-loop的加工过程,作者们使用了GFP标记的重组催化失活型Rnase H1(GFP-dRH)对RNA-DNA杂交进行可视化研究。作者们发现在敲除SETX或者BRCA1后,会导致细胞中RNA-DNA杂交体信号增加。这说明在细胞质中RNA-DNA杂交体在细胞质中累积(Figure 1)。为了进一步对这一杂交核酸进行表征,作者进一步地证实了SETX或BRCA1的缺失以及剪接抑制剂PlaB处理会导致RNA-DNA杂交片段累积。

 

Figture1 RaseH(RH)预处理后的GFP-dRH蛋白图像

 

为了进一步追踪累积的RNA-DNA杂交体的来源,作者们分别对对照组细胞和SETX缺失型细胞将cytoDRIP以及链特异性RNA-DNA杂交体相结合进行测序。作者们在对照组细胞中鉴定出866个峰,在SETX缺失型细胞中鉴定出5726个峰(Figure 2)。大多数的位点对Rnase H处理具有敏感性。在基因内,大多数cytoDRIP位点发生在基因体中;而在基因间区域,增强子则具有RNA-DNA杂交体信号的显著富集。另外,作者们还发现简单重复序列和低复杂度重复序列、着丝粒和rDNA等区域细胞内R-loop出现的概率会明显升高。因此,累积出现的RNA-DNA杂交体来源于基因组,且具有一定的富集特征。

 

Figure 2 DRIP信号值可视化

 

进一步地,作者们检测了细胞质中出现的R-loop的稳定性,发现这些R-loop的半衰期是43-67分钟。随后,作者们发现RNA-DNA杂交体会引发细胞中的先天性免疫反应,激活IRF3信号途径并诱导细胞凋亡。为了测试当R-loop被诱导时,哪些先天免疫传感器介导IRF3的激活,作者们在SETX敲除型细胞中分别敲除了TLR3、RIGI、MDA5或cGAS,发现抑制cGAS和TLR3能够强烈降低磷酸化的IRF3以及下游效应因子,但是抑制RIGI或MDA5的影响并不大。这些结果表明R-loop诱导的IRF3信号主要是由cGAS和TLR3介导的(Figure 3)。

 

Figure 3 R-Loop通过cGAS和TLR3受体触发IRF3信号传导

 

总的来说,作者们的工作发现R-loop加工过程中会在细胞质中产生RNA-DNA杂交体累积,这一累积过程依赖于内切酶。作者们发现内源性细胞质RNA-DNA杂交体被免疫受体cGAS和TLR3感知,引发先天性免疫反应和细胞凋亡。

案例解读二:R环与m6A修饰

主题:DDX21 介导共转录 RNA m6A修饰以促进转录终止和基因组稳定性

原文:DDX21mediates co-transcriptional RNA m6A modification to promote transcription termination and genome stability

期刊:molecular cell            影响因子:16             发表时间:2024.5.2

 

基于之前的研究,m6A 在 R 环上存在以及大多数 R 环是共转录形成的,因此推测 R 环可能在 m6A 的共转录修饰中发挥作用。为了检验这一假设并研究 m6A 在 R 环上共转录安装的机制,作者进行了CO-IP-MS质谱测定,METTL3、METTL14和WTAP相关的29个蛋白质的重叠,包括已知的m6相关修饰因子。在未表征的相互作用子中,解旋酶DDX21和DHX9因其靶向R环的能力而备受关注。作者进一步验证了DDX21与METTL3、METTL14和WTAP的相互作用几乎不依赖DNA或RNA,并证实DDX21和METTL3之间的直接相互作用(Figure1)。

 

Figure 1 DDX21 与 m6A 甲基转移酶复合物(MTC)直接结合

 

接下来,作者研究了 DDX21 和 METTL3 之间的相互作用与新生转录本的靶向相关,通过caPAR-CLIP-seq,识别全基因组范围内 DDX21 和 METTL3 靶向的新生转录本。 发现两者在新生转录本上的靶向具有一致性,共享4,626个结合位点。METTL3的caPAR-CLIP信号集中在DDX21峰周围,表明它们在新生转录本上的共定位受到DDX21和METTL3相互作用的促进。作者还研究了R环在引导DDX21和MTC到达其caRNA靶标方面的作用,发现ssDRIP-seq检测到的R环信号在DDX21和METTL3-caRNA结合位点周围表现出相似水平的富集,进一步支持了DDX21-METTL3和R环现场招募之间的正相关性(Figure 2)。

 

Figure 2 DDX21靶向R环来介导METTL3的染色质募集

 

作者为了评估METTL3的下游活动需要R环和DDX21介导的METTL3募集到染色质。监测了METTL3招募受损时caRNA中m6A水平的变化。RNase H过表达去除了METTL3对染色质的锚定,发现caRNA中m6A水平显着降低。R环耗尽后的MeRIP-qPCR进一步验证了这种减少。对于DDX21,敲除全局性抑制了caRNA中m6A修饰的水平,与R环被破坏时相似。MeRIP-qPCR显示,DDX21缺失引起的m6A减少与METTL3缺失引起的m6A减少相当。此外,DDX21截短突变体不能与METTL3相互作用,且不能恢复m6A修饰至野生型水平。这表明DDX21在共转录m6A修饰中起重要作用,作为将METTL3招募到染色质结合R环的介质(Figure 3)。

Figure 3 DDX21通过其解旋酶活性促进m6 A对caRNA的修饰

 

由于DDX21推动的共转录m6A峰聚集在基因末端,研究者探索了这种关系如何影响转录的终止过程。研究发现,m6A修饰以共转录方式添加,并在DDX21缺失时减少。作者还观察到DDX21和METTL3在ACTB的RNA P II暂停位点上富集,这种招募依赖于R环。RNase H的过表达使富集减少了一半以上,而METTL3对DDX21的存在有额外要求。这表明DDX21和METTL3通过R环的招募在ACTB的转录终止中发挥了重要作用(Figure 4)。

Figure 4 DDX21和METTL3促进XRN2介导的RNAPII转录终止

 

总之,在这项研究中,作者提出了一个独特的分子轴,该轴将共转录 m6A 甲基化靶向染色质,同时对染色质进行共转录调控。具体来说,作者已经证明 DDX21 直接与 MTC 相互作用,将其招募到染色质,其中 R 环的识别提供了锚定点。然后,DDX21 的解旋酶活性在 R 环中呈现 caRNA,以实现 METTL3 的甲基转移酶活性,R 环或 DDX21 的耗尽导致整体 m6A 水平降低。 在终止位点,轴延伸以促进 XRN2 的招募和作用,进而促进转录终止。 沿轴的任何步骤的破坏都可能最终导致转录通读和随之而来的 DNA 损伤。揭示了一条以前未被识别的共转录 m6A 沉积和现场功能的途径,为协调转录调控和基因组稳定性的分子机制提供了重要的见解。

 

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