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用户文章IF=12.4| 云序m6A MeRIP-seq助力揭示食管癌中甲硫氨酸发挥促癌功能的分子机制

发布时间:2024-04-25 11:14 |  点击次数:

代谢改变是癌症的核心标志,在癌症的发生和发展中起着直接作用。最近的研究报道了饮食通过改变癌细胞代谢对癌症生长和进展的影响。其中,甲硫氨酸作为人体必需氨基酸,已被发现在肺癌中对肿瘤启动细胞的扩增起关键作用。

2024年4月3日,云序客户上海中医药大学附属龙华医院肿瘤研究所陈文连团队在国际权威期刊Cell Death Differentiation (IF=12.4)上发表了题为“Unveiling the methionine cycle: a key metabolic signature and NR4A2 as a methionine-responsive oncogene in esophageal squamous cell carcinoma”的研究性论文。该团队在深入分析临床标本的代谢组学数据时,发现ESCC患者的肿瘤组织中有高度活跃的甲硫氨酸(Met)代谢;进一步发现ESCC细胞可大量摄取Met来合成S-腺苷甲硫氨酸(SAM),然后通过m6A MeRIP-seq、RNA-seq等高通量测序技术揭示了“METTL3-RNA m6A-IGF2BP2”调控轴,发现了一个ESCC治疗的新靶点。

标题:Unveiling the methionine cycle: a key metabolic signature and NR4A2 as a methionine-responsive oncogene in esophageal squamous cell carcinoma

发表时间:2024年4月3日

发表期刊:Cell Death Differentiation

影响因子:IF=12.4/Q1

研究方法: m6A MeRIP-seq、 RNA-seq、RIP-qPCR、WB、dot blot

 

研究摘要

食管鳞状细胞癌(ESCC)是一种具有显著代谢重编程的致命恶性肿瘤,然而驱动ESCC进展的关键代谢特征仍然难以捉摸。在这里,作者发现甲硫氨酸周期在ESCC中表现出强大的激活,并且与患者生存率呈负相关。ESCC细胞容易利用外源甲硫氨酸生成S -腺苷甲硫氨酸(SAM),从而促进细胞增殖。从机制上讲,甲硫氨酸通过SAM增强METTL3介导的RNA m6A甲基化,并修改基因表达。整合组学分析强调了甲硫氨酸/ S-腺苷甲硫氨酸(SAM)以肿瘤特异性方式对NR4A2表达的有效影响,这是由依赖IGF2BP2的甲基化NR4A2 mRNA稳定介导的。作者证明NR4A2促进ESCC生长并对患者生存产生负面影响,进一步发现塞来昔布是一种有效的NR4A2抑制剂,有望成为一种新的抗ESCC药物。总之,作者的研究结果强调了活跃的甲硫氨酸循环是ESCC的关键代谢特征,并指出NR4A2是一种新的甲硫氨酸应答癌基因,因此提出了一个令人信服的靶标,可能优于甲硫氨酸限制。

技术路线

公众号技术路线2-20240419

*红色部分技术服务云序均可提供

 

研究结果

(1)甲硫氨酸循环在临床ESCC组织中异常活跃,可预测患者的不良生存率

为评估临床 ESCC 组织中代谢通路活性的变化,作者对已报道的ESCC组织代谢组数据集重新分析,发现与配对的正常邻近组织(NATs)相比,ESCC组织中83.19%的差异代谢物上调(图1A)。通过基于KEGG通路的差异丰度分析,发现了甲硫氨酸代谢通路在肿瘤组织中表现出上调(差异丰度分数≥0.5)(图1B),表明 ESCC 组织中甲硫氨酸代谢异常活化。甲硫氨酸循环产生的SAM可为多种生物大分子的甲基化提供甲基基团(图1C)。作者的研究结果表明,在临床 ESCC 组织中,这一代谢途径可能会受到刺激,这一点可以从参与该途径的甲硫氨酸和半胱氨酸(Hcy)水平的升高得到证明。

作者发现与配对的 NATs 相比,临床ESCC组织中参与甲硫氨酸循环的四种代谢物的水平明显上调(图 1D),进一步证实ESCC中该通路的过度激活。PCA模型和多变量 Cox 回归分析结果突显了甲硫氨酸上调作为一种新的、独立的预测 ESCC 患者不利生存的生物标志物的重要性。其次,作者对公开基因表达数据集GSE23400分析,显示SLC7A5和上述代谢酶在ESCC组织中的转录水平上调。组织切片的免疫组织化学(IHC)染色显示,与NATs相比,临床ESCC组织中SLC7A5、MAT2A、MAT2B和AHCY的蛋白水平明显升高。总的来说,作者的结果提供了代谢产物和代谢酶水平上甲硫氨酸循环异位激活的全面证据。此外,作者建立了这种代谢途径与ESCC患者预后之间的反向关联。

01

图1:临床 ESCC 组织中的诱发甲硫氨酸循环

 

(2)高甲硫氨酸通过SAM促进ESCC的生长,而低甲硫氨酸则会产生不利影响

在临床 ESCC 组织中观察到的活跃的甲硫氨酸循环是否意味着 ESCC 细胞对外源性甲硫氨酸的摄取和利用。作者选择了两种ESCC细胞系进行体外检测。与不含甲硫氨酸的培养基中培养的细胞相比,含甲硫氨酸的培养基中培养的细胞显示出细胞内甲硫氨酸及其下游代谢产物 SAM 水平的升高(图 2A,B)。随后,作者使用从患者身上采集新鲜的ESCC组织进行体外检测,发现在培养基中培养的 ESCC 组织瘤内甲硫氨酸和 SAM 水平明显更高(图 2C)。结果表明ESCC 细胞系和来自患者的原代新鲜 ESCC 组织都能有效消耗外源性甲硫氨酸生成 SAM。其次,使用皮下异种移植小鼠模型进行体内研究,发现膳食甲硫氨酸以剂量依赖的方式显著加速异位ESCC肿瘤的生长,同时增强肿瘤内细胞周期蛋白的表达(图2D-G)。采用4-硝基喹lin1-氧化物(4-NQO)诱导的ESCC小鼠模型进行体内研究,通过饮用水口服甲硫氨酸可显著加速原位ESCC肿瘤的生长,并上调肿瘤内另一种细胞增殖标志物的表达(图2H-J)。这些发现表明外源甲硫氨酸及其下游代谢物SAM对ESCC的生长至关重要。

与高甲硫氨酸饮食相比,低甲硫氨酸饮食导致ESCC异种移植肿瘤小鼠在肿瘤移植31天后体重下降11.6-14.7%,表明MR有相当大的不良影响。这就提出了识别甲硫氨酸互反应癌基因,而不是MR作为ESCC新治疗靶点的必要性。

02

图2:ESCC 生长需要甲硫氨酸及其下游代谢物SAM

 

(3)ESCC的RNA m6A甲基化通过甲硫氨酸-SAM-MELLT3 级联得到增强

作者推测甲硫氨酸可能通过改变RNA m6A修饰来改变某些癌基因的表达,从而促进ESCC的生长。作者从ESCC组织及其匹配的NATs中提取RNA样本,dot blot结果显示相对于配对的NATs,临床ESCC组织中的RNA m6A甲基化显著增加(图3A, B)。重要的是,在培养基中去除甲硫氨酸后,ESCC细胞系和患者的原代新鲜ESCC组织的RNA m6A甲基化都明显减弱(图3C, D),补充SAM显著恢复RNA修饰(图3E)。这些发现最终证明了甲硫氨酸及其代谢物SAM在ESCC中维持RNA m6A甲基化的重要作用。对已发表蛋白质组数据的重新分析显示,在临床 ESCC 组织中,三种 m6A写入酶(METTL3、METTL14 、 METTL16)以及两种辅助因子 WTAP 和 RBM15B 有显著上调(图3F)。作者发现METTL3的缺失严重损害了ESCC细胞中甲硫氨酸诱导的RNA m6A修饰(图3G, H)。与此一致的是,使用METTL3抑制剂STM2457也显著抑制了ESCC细胞中甲硫氨酸诱导的RNA m6A信号(图3I)。此外,与NATs相比,临床ESCC组织中METTL3的表达显著增加(图3J-M)。总的来说研究结果表明,通过甲硫氨酸- SAM - METTL3级联,RNA m6A修饰在临床ESCC组织中显著上调。

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图3:甲硫氨酸-SAM-METTL3级联导致ESCC中RNA m6A甲基化加剧

 

(4)多组学分析显示,在甲硫氨酸刺激下NR4A2的表达与其mRNA的m6A强度呈正相关

作者对体外培养的KYSE150细胞和4- nqo诱导的ESCC小鼠食管组织进行了RNA-seq,以鉴定甲硫氨酸调控基因。体外和体内模型共有8527个基因待鉴定。基因相关分析显示,甲硫氨酸给药对基因表达的影响在体外和体内条件下存在显著差异。随后,作者观察到甲硫氨酸处理对体外模型中基因的表达有显著的扰动(图4A, B)。重要的是,Venn图显示了甲硫氨酸在体外和体内持续调节的7个基因,包括核受体亚家族4组A成员2 (NR4A2)(图4C)。随后,作者采用MeRIP-seq研究甲硫氨酸对KYSE150细胞RNA m6A特征的影响。与先前的研究一致,GGACU的m6A基序在KYSE150细胞的免疫纯化mRNA中高度富集(图4D)。甲硫氨酸诱导的m6A峰主要位于mRNA的3 ' UTR附近和3 ' UTRs(图4E)。KEGG通路富集分析显示,m6A修饰转录本富集于癌症相关通路和生物过程。

然后,作者使用RNA-seq和MeRIP-seq数据对甲硫氨酸在体外和体内一致调节的七个基因进行了综合分析。仅在NR4A2、ALDH3B1、ANKRD37、SOX9和DUSP5中观察到m6A峰(图4F)。这一发现提示甲硫氨酸可能通过修饰m6A引起基因表达变化。在甲硫氨酸存在的情况下,NR4A2和DUSP5 mRNA中都有四个主要的m6A峰,NR4A2 mRNA中有三个m6A峰的FC值大于10(图4F)。因此,作者将重点放在NR4A2上进行进一步的研究。值得注意的是,甲硫氨酸引发的NR4A2 mRNA中四个主要的m6A峰位于几个外显子8和3 ' -UTR(图4G)。作者构建了一个包含NR4A2启动子序列的报告基因,补充甲硫氨酸并没有干扰NR4A2启动子的表达(图4H),这表明甲硫氨酸处理增加了NR4A2的表达,而不是通过上调其转录。综上所述,作者的研究结果表明,甲硫氨酸显著扰乱了ESCC细胞的基因表达模式和RNA m6A甲基化,特别是诱导NR4A2的表达和m6A修饰。

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图4:RNA-seq和MeRIP-seq联合分析发现NR4A2是甲硫氨酸的一个重要下游基因

 

(5)甲硫氨酸通过SAM-METTL3-m6A - IGF2BP2级联增强NR4A2 mRNA的稳定性,从而刺激NR4A2表达

作者使用RNA-seq、qPCR、Western blot和 IHC 检测法进行的分析表明,在体外和体内模型中,甲硫氨酸都能在 mRNA 和蛋白质水平上诱导 ESCC 中 NR4A2 的表达(图4F和5A、B)。重要的是,甲硫氨酸能特异性地诱导肿瘤细胞中 NR4A2 的表达,因为在甲硫氨酸存在的情况下,未转化的食管上皮细胞系 Het-1A 中 NR4A2 的表达没有变化(图5A)。

为了解甲硫氨酸和SAM如何触发ESCC细胞中NR4A2的表达,用全局甲基化抑制剂处理ESCC细胞,在mRNA和蛋白质水平上显著降低了甲硫氨酸和SAM诱导的NR4A2表达(图5C, D)。此外,ESCC细胞中METTL3的缺失显著抑制了甲硫氨酸和SAM诱导的全局RNA m6A甲基化(图3G, H),并在mRNA和蛋白质水平上减弱了NR4A2的表达(图5E)。此外,使用METTL3抑制剂STM2457治疗也下调了NR4A2的表达。这些发现表明,甲硫氨酸和SAM通过mettl3介导的m6A甲基化在RNA水平上调NR4A2的表达。用转录抑制剂放xian菌素D治疗显示,甲硫氨酸给药明显延缓了NR4A2 mRNA的衰变(图5F)。相反,在放xian菌素D存在的情况下,METTL3的缺失显著加速了甲硫氨酸诱导的NR4A2 mRNA的降解(图5G)。综上所述,这些发现表明甲硫氨酸诱导的NR4A2在ESCC细胞中的表达是由METTL3-m6A触发的mRNA稳定化介导的。

考虑到甲硫氨酸诱导NR4A2 mRNA的4个m6A峰中有一个位于3 ' -UTR,作者推测IGF2BP会识别这个m6A峰并促进mRNA的稳定性。作者进行RNA RIP-qPCR分析,发现IGF2BP2对KYSE150细胞中NR4A2 mRNA的亲和力最高(图5H)。发现IGF2BP2的缺失显著加速了NR4A2 mRNA的衰变,降低了ESCC细胞中NR4A2的蛋白丰度(图5I, J)。因此,甲硫氨酸可以通过SAM-MELLT3-m6A -IGF2BP2级联增强NR4A2 mRNA的稳定性并增加其表达量。

基于MeRIP-seq数据,作者以高置信度预测了NR4A2 mRNA内的三个m6A一致性序列(图5K)。因此,作者构建了两个包含NR4A2全长编码序列的突变体,在6号外显子或8号外显子的m6A一致序列中进行了A- T替换(图5K)。qPCR结果显示,在甲硫氨酸存在的情况下,与野生型NR4A2相比,这两个突变体没有改变NR4A2 mRNA的衰减率(图5L)。此外,作者生成了含有NR4A2野生型或突变型3 ' -UTR片段的报告基因(图5K)。与NR4A2的野生型3 ' -UTR片段相比,3 ' -UTR的m6A一致序列突变导致甲硫氨酸诱导的NR4A2表达减少25.9%(图5M)。总之,这些结果表明NR4A2的3 ' -UTR中的m6A修饰是甲硫氨酸诱导的NR4A2 mRNA稳定所必需的。

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图5:甲硫氨酸通过 METTL3-m6A-IGF2BP2 级联诱导 NR4A2 的表达

 

(6)NR4A2促进体外和体内ESCC的生长

在确定NR4A2为甲硫氨酸应答基因后,作者研究了其生物学作用。作者观察到NR4A2的缺失阻碍了ESCC细胞的增殖,而NR4A2的过表达增强了ESCC细胞的增殖(图6A-D)。此外,NR4A2敲除导致细胞周期阻滞在G2/M期(图6E, F)。作者利用异种移植肿瘤小鼠模型来验证NR4A2在ESCC中的致癌作用,发现高饲粮甲硫氨酸显著加速了植入对照ESCC细胞的肿瘤生长,但对缺乏NR4A2的ESCC细胞没有作用(图6G-I)。在高甲硫氨酸饮食存在的情况下,肿瘤内PCNA和Cyclin B1的表达被NR4A2缺失显著抑制(图6I-J)。结果表明NR4A2的表达在体内对甲硫氨酸诱导的ESCC肿瘤扩增至关重要,NR4A2抑制可以作为一种有希望的替代MR的方法。

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图6:NR4A2 在 ESCC 生长中的关键作用

 

(7)NR4A2在ESCC中高度表达,并与患者的预后呈负相关

qPCR分析显示,与配对的NATs相比,ESCC组织中NR4A2 mRNA水平显著升高(图7A)。免疫组化分析显示,相对于NATs, ESCC组织中NR4A2蛋白的丰富度显著增加(图7B、C)。这些结果表明NR4A2在ESCC临床组织中mRNA和蛋白水平均升高。预后分析显示,ESCC组织中NR4A2的高表达预示着患者不利的OS和DFS(图7D, E)。此外,NR4A2的IHC评分分别与SLC7A5、MAT2A、MAT2B和METTL3的IHC评分密切相关,呈正相关(图7F-M)。这强调了甲硫氨酸循环- METTL3- mRNA m6A - NR4A2级联在ESCC中的存在。

综上所述,本研究提出了一种新的甲硫氨酸在ESCC中的促瘤机制(图7N)。SAM主要以METTL3依赖的方式在NR4A2 mRNA中提供活性甲基和增强m6A甲基化。随后,一个读写器蛋白IGF2BP2结合到NR4A2 mRNA的3 ' -UTR的特定m6A位点,促进其稳定性和储存。最终,这导致NR4A2基因表达输出显著增加,从而促进ESCC生长。

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图7:NR4A2对ESCC患者的临床意义

 

(8)塞来昔布是一种具有明显抗ESCC疗效的NR4A2抑制剂

作者对抑制剂进行了筛查,发现只有塞来昔布以剂量依赖性方式明显下调ESCC细胞中NR4A2蛋白丰度(图8A)。塞来昔布治疗并未干扰ESCC细胞中的NR4A2转录(图8B),可显著加速NR4A2的降解(图8C),表明塞来昔布可以增强NR4A2蛋白的稳定性。细胞热移测定(CETSA)表明,塞来昔布补充剂引起NR4A2蛋白显著的热移,进一步表明该化合物与NR4A2蛋白之间存在直接相互作用。体外研究显示,NR4A2缺失降低了KYSE150细胞对塞来昔布的敏感性(图8F)。体内研究表明,在高甲硫氨酸饮食条件下,口服塞来昔布可显著抑制皮下KYSE150异种移植肿瘤的生长,并下调瘤内NR4A2水平(图8G-J),与低甲硫氨酸饮食或著名的化疗药物顺铂(CDDP)在高甲硫氨酸饮食条件下的作用相当(图8I)。结果表明塞来昔布在体内的安全性优于MR饮食或CDDP治疗。

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图8:塞来昔布是一种具有抗ESCC效力的NR4A2抑制剂

 

全文小结

发现临床ESCC组织中甲硫氨酸循环明显激活,并与患者生存率呈负相关;

发现甲硫氨酸容易被ESCC利用来产生SAM,从而促进ESCC的生长;

通过甲硫氨酸- SAM-METTL3级联证明了临床ESCC组织RNA样本中m6A丰度显著上调;

甲硫氨酸通过SAM-METTL3-RNA m6A - IGF2BP2级联正调控下游基因NR4A2;

筛选出一种靶向NR4A2的抑制剂——塞来昔布,在富含甲硫氨酸的饮食中显示出明显的抗ESCC生长功效和安全性。

 

 

云序生物m6A修饰研究五大模块

01 m6A RNA修饰测序

m6A RNA修饰单碱基测序(GLORI-Seq)

GLORI(Glyoxal and nitrite-mediated deamination of unmethylated adenosine)技术是针对m6A修饰开发的单碱基检测技术。实现了真正意义的高效率、高灵敏度、高特异性、无偏好单碱基m6A位点检测,并对m6A位点的修饰水平进行绝对定量。

m6A RNA修饰测序(m6A-MeRIP-seq)

对m6A RNA甲基化,目前流行的检测手段为m6A-MeRIP-Seq技术,适用于m6A RNA甲基化谱研究,快速筛选m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多种非编码RNA的m6A测序:

m6A 全转录组测序(涵盖mRNA,LncRNA,circRNA)

m6A  LncRNA测序(涵盖LncRNA和mRNA)

m6A  Pri-miRNA测序(涵盖Pri-miRNA和mRNA)

m6A  mRNA测序

m6A  miRNA测序

02 检测整体m6A修饰水平

比色法检测整体RNA修饰水平

快速检测m6A整体甲基化水平

03 m6A RNA修饰上游酶的筛选

m6A RNA修饰相关酶PCR芯片

寻找上游直接调控m6A RNA甲基化的甲基转移酶。

04 m6A RNA修饰靶基因验证

MeRIP-qPCR/GenSeq® MeRIP试剂盒

云序提供各类不同修饰的MeRIP-qPCR服务以及销售GenSeq® MeRIP试剂盒,可针对mRNA,lncRNA,环状RNA等不同类型的RNA分子进行检测,低通量验证RNA修饰靶基因表达水平。

05 机制互作研究

5.1 RIP-seq/qPCR/GenSeq® RIP试剂盒

筛选或验证RNA修饰直接靶点,研究RNA修饰靶基因的调控机制。

5.2 RNA pull down -MS/WB

筛选或验证目标RNA互作基因或蛋白,研究相应的分子调控机制。

5.3 ChIP-seq

筛选或验证目标蛋白与DNA互作,研究相应的分子调控机制。

5.4 Ribo-seq

筛选翻译水平发生变化的RNA分子,研究相应的分子调控机制。

5.5 SLAM-seq

筛选稳定性发生变化的RNA分子,研究相应的分子调控机制。

5.6 CHIRP-seq

筛选或验证目标RNA与DNA互作,研究相应的分子机制。

 

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云序生物服务优势

优势一:云序累计支持客户发表数百篇SCI论文,合计影响因子3000 +

优势二:累计完成测序样本数万例,全面覆盖医口、农口等各类样本。

优势三:全面检测mRNA和各类非编码RNA(circRNA,lncRNA,Pri-miRNA等)。

优势四:提供RNA修饰一站式服务:整体水平检测、RNA修饰研究、MeRIP-qPCR验证、RIP-seq、RNA pull-down、Ribo-seq和SLAM-seq等。

优势五:率先研发超微量MeRIP测序技术,RNA量低至500ng起。

优势六:国内较全的RNA修饰测序平台,提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙酰化和2'-O-甲基化、假尿嘧啶等修饰的测序技术。

 

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