2023年11月13日，中山大学肿瘤防治中心研究者在Nature Genetics发表了题为 Super-enhancer RNA m6A promotes local chromatin accessibility and oncogene transcription in pancreatic ductal adenocarcinoma 的研究成果。通过m6A MeRIP-seq、PAR-CLIP-seq，RNA-seq等测序技术发现首次揭示了胰腺癌中seRNA m6A修饰对组蛋白修饰和癌基因表达的调控，扩展了人们对超级增强子及其转录本功能新的认知。

 

 

标题： Super-enhancer RNA m6A promotes local chromatin accessibility and oncogene transcription in pancreatic ductal adenocarcinoma

发表时间：2023/11/13

发表期刊：Nature Genetics

影响因子：IF=30.8/Q1

研究方法：m6A meRIP-seq、RNA-seq、PAR-CLIP-seq、CoIP-MS、RNA pull down、CUT&Tag-seq、ATAC-seq

 

研究摘要

 

目前，人们对于非编码RNA m6A修饰的生物学功能仍知之甚少。本研究描绘了胰腺导管腺癌( PDAC )中超级增强子RNA ( seRNA )的 m6A修饰情况，并揭示了m6A seRNA、H3K4me3修饰、染色质可及性和癌基因转录的调控轴。

研究证明了在PDAC中过表达的cofilin家族蛋白CFL1作为METTL3的辅助因子，有助于seRNA m6A甲基化的形成。增加的se RNA m6A修饰被reader YTHDC2识别，YTHDC2招募H3K4甲基转移酶MLL1，促进H3K4me3共转录修饰。具有高水平H3K4me3的超级增强子增加染色质的可及性并促进癌基因的转录。总的来说，这些结果揭示了CFL1 - METTL3-seRNA m6A-YTHDC2/MLL1轴在局部染色质状态和基因表达的表观遗传调控中发挥作用，这加强了对超级增强子及其转录本功能的认识。

技术路线

研究结果

（1）PDAC seRNAm6A修饰图谱

通过ENCODE和GEO数据库中正常胰腺和PDAC的H3K27ac ChIP-seq 数据，共注释到18311个超级增强子区域，在65个PDAC和33个正常组织的RNA-seq中也检测到了上述seRNA，其中17467个seRNA在10%以上样本中均表达(图a)。超级增强子标志物H3K27ac，H3K4me3和H3K4me1在识别到的区域中心上下游2kb范围内富集，而阴性对照H3K27me3没有富集。

对65个PDAC ( 33例配对样本，32例非配对样本)中的seRNA进行m6A meRIP-seq ，在17467个seRNA中检测到5375个(30.77 % )带有m6A修饰(图a)，且分布在整个seRNA中(图b )，富含m6A典型RRACH基序(图c)。其中共有410个差异m6A seRNA，其中398个m6A seRNA (97.07 %)在PDAC中上调，12个下调(2.93%)(图d)，IGV可视化与m6A -meRIP-qPCR结果均表明多个seRNA m6A水平在PDAC中高于正常组织，有16个seRNAs m6A上调与PDAC患者较短的无进展生存( PFS )时间显著相关(HR >1.00; (FDR) P < 0.05）。

 

（2）CFL1在PDAC中seRNA m6A的异常形成中起关键作用

为了探究PDAC seRNA m6A异常增加的原因，研究人员在数据库中搜索了与m6A常见writer（METTL3、METTL14、WTAP和K97%AA1429）相互作用的RNA结合蛋白（RBPs），发现CFL1蛋白对seRNA m6A水平贡献分数最高(图e)，且显著相关(图f)。通过RNA-seq以及数据库数据表明CFL1 mRNA水平在PDAC中显著高于正常组织(图g )，在广州和北京采集的另外2个样品中也验证了这些结果(图h)，对30对配对的PDAC和正常样本的进行WB，PDAC的CFL1蛋白水平也明显高于正常组织。KM生存曲线和多因素Cox比例风险模型分析显示，高CFL1水平(>=中位数)的PDAC比低CFL1水平( <中位数)的具有更短的生存时间。

 

 

（3）CFL1是seRNA m6A形成过程中的METTL3辅助因子

对PANC-1细胞进行CFL1敲除和NC进行了m6A meRIP-seq，结果显示有3217(77.07%)个seRNAs m6A水平下调，占在PDAC中m6A上调的seRNA 69.10 % (图b )。通过CFL1 PAR-CLIP-seq发现大多数CFL1结合峰位于远端基因间和内含子远端，且与CFL1-KO组下调m6A区域大幅重叠。因CFL1可能通过ROCK / LIMK / cofilin通路促进癌症进展，因此研究人员通过m6A meRIP-seq检测在Cyto D处理及NC中m6A修饰，Cyto D处理并没有对seRNA m6A整体修饰水平产生影响，说明PDAC细胞中CFL1产生的seRNA m6A可能不依赖于ROCK / LIMK / cofilin通路，而是依赖于核内CFL1本身。

CoIP实验及RNA Pull down-WB证明了CFL1和METTL3的直接相互作用(图d)，免疫荧光实验显示CFL1与METTL3在PANC-1细胞核中存在共定位(图e)，结构域检测显示METTL3锌指结构域( ZnF1 ,氨基酸259 ~ 298)是CFL1结合所必需的(图f)。

通过METTL3 KO vs NC m6A meRIP-seq检测了METTL3对总RNA和核RNA中seRNA m6A水平的影响，发现METTL3- KO细胞中seRNA m6A降低与CFL1-KO的下调的seRNA大部分相同(图h)。PAR-CLIP-seq分析还表明，CFL1和METTL3在CFL1 KO相关的m6A下调 seRNAs的TSS附近富集。RIP-qPCR验证了CFL1或METTL3与这些seRNA存在相互作用，并且在敲除细胞中，m6A水平显著降低。CFL1-KO细胞中seRNAs(n =2373,图2k)的METTL3结合信号显著降低，RIP - qPCR证实了这一点(图2l )。进一步利用dPspCas13b - CFL1系统在CFL1 - KO细胞中验证了CFL1的功能，表明CFL1是seRNA m6A修饰的METTL3辅助因子。

 

 

（4）SeRNA m6A通过YTHDC2 - MLL1相互作用使H3K4me3甲基化

m6A通常由reader介导发挥作用，结合已发表数据，发现m6A seRNA上的YTHDC2结合密度较高，YTHDC2 PAR-CLIP-seq结果显示YTHDC2在基因间区和内含子区富集(图f )，且结合位点几乎与m6A seRNAs重叠，RNA Pull down-WB验证了YTHDC2与m6A se RNA的相互作用。RIP-qPCR分析表明，CFL1 -或METTL3 - KO导致YTHDC2显著降低。通过dPspCas13b - METTL3系统在CFL1 - KO细胞中验证了m6A、YTHDC2和H3K4me3的作用,YTHDFC2突变实验完全抑制了YTHDC2对m6A - seRNAs的识别。YTHDC2 - KO与CFL1-KO一样同样降低了H3K4me3峰。

YTHDC2 CoIP -MS鉴定到MLL1富集，CoIP-WB验证了YTHDC2与MLL1的相互作用，免疫荧光实验显示YTHDC2与MLL1在细胞内存在共定位。YTHDC2，MLL1和H3K4me3共定位于m6A seRNA相关的染色质上，并且MLL1和H3K4me3信号在YTHDC2-KO上减弱(图d )。CUT&Tag-seq和核RNA PAR-CLIP-seq结果显示，YTHDC2在超级增强子中的定位与seRNA中的YTHDC2有很好的重叠，还发现了YTHDC2、MLL1和H3K4me3共定位，并且YTHDC2 - KO显著降低MLL1或H3K4me3信号(附图3a)。这些结果表明，m6A seRNAs通过YTHDC2和MLL1相互作用，在转录水平上共同促进了局部染色质H3K4me3修饰。

 

 

（5）m6A seRNAs引起染色质开放和致癌基因转录

为了研究CFL1-m6A-YTHDC2/MLL1-H3K4me3轴对染色质可及性的影响，在CFL1-KO、YTHDC2-KO或MLL1 - KO或non - KO PANC - 1细胞中通过ATAC-seq分析了可及性染色质，当CFL1，YTHDC2或MLL1被敲除时，有10300个共有区域ATAC缺失，主要富集在内含子、远端基因间区和启动子区域(图a,b )。

RNA-seq结果显示，与non- KO相比，1743个基因在CFL1 - KO中显著下调，富集于缺氧和mTORC1信号传导(图d ,右)等11个癌症相关过程，这些基因在数据集及PDAC数据库中均显著上调。此外结合数据集，发现图d所示的通路得分与CFL1-YTHDC2 - MLL1特征得分或肿瘤样本和单细胞样本中的或CFL1水平之间存在显著相关性(图f)。高水平的MICAL2和AMIGO2 (由两个hyper-m6A seRNA调控)与患者较短的PFS显著相关。这些结果表明，m6A se RNA相关的CFL1 - YTHDC2 / MLL1轴在重塑染色质可及性和癌基因转录中发挥重要作用。

 

 

（6）m6A seRNA相关的CFL1促进PDAC细胞的恶性表型

最后研究了CFL1是否对PDAC细胞的恶性表型有影响，发现异位过表达CFL1显著促进PDAC细胞在体外和体内的增殖、迁移、侵袭和转移，而CFL1 - KO具有相反的作用，同时还发现METTL3 -KO或YTHDC2 - KO显著抑制PDAC细胞恶性表型。将野生型METTL3或缺失CFL1结合区域的突变型METTL3转染到CFL1过表达和METTL3沉默的细胞中，结果显示野生型METTL3恢复了恶性细胞表型，而突变型METTL3恢复了恶性细胞表型。综上所述，这些结果表明m6A seRNA形成相关的CFL1在PDAC中发挥致癌作用。

云序生物m6A修饰研究五大模块

01 m6A RNA修饰测序

m6A RNA修饰单碱基测序（GLORI-Seq）

GLORI（Glyoxal and nitrite-mediated deamination of unmethylated adenosine）技术是针对m6A修饰开发的单碱基检测技术。实现了真正意义的高效率、高灵敏度、高特异性、无偏好单碱基m6A位点检测，并对m6A位点的修饰水平进行绝对定量。

m6A RNA修饰测序（m6A-MeRIP-seq）

对m6A RNA甲基化，目前流行的检测手段为m6A-MeRIP-Seq技术，适用于m6A RNA甲基化谱研究，快速筛选m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多种非编码RNA的m6A测序：

• m6A 全转录组测序（涵盖mRNA，LncRNA，circRNA）

• m6A  LncRNA测序（涵盖LncRNA和mRNA）

• m6A  Pri-miRNA测序（涵盖Pri-miRNA和mRNA）

• m6A  mRNA测序

• m6A  miRNA测序

02检测整体m6A修饰水平

比色法检测整体RNA修饰水平

快速检测m6A整体甲基化水平

03 m6A RNA修饰上游酶的筛选

m6A RNA修饰相关酶PCR芯片

寻找上游直接调控m6A RNA甲基化的甲基转移酶。

04 m6A RNA修饰靶基因验证

MeRIP-qPCR/GenSeq® MeRIP试剂盒

云序提供各类不同修饰的MeRIP-qPCR服务以及销售GenSeq® MeRIP试剂盒，可针对mRNA，lncRNA，环状RNA等不同类型的RNA分子进行检测，低通量验证RNA修饰靶基因表达水平。

05机制互作研究

5.1 RIP-seq/qPCR/GenSeq® RIP试剂盒

筛选或验证RNA修饰直接靶点，研究RNA修饰靶基因的调控机制。

5.2 RNA pull down -MS/WB

筛选或验证目标RNA互作基因或蛋白，研究相应的分子调控机制。

5.3ChIP-seq

筛选或验证目标蛋白与DNA互作，研究相应的分子调控机制。

5.4Ribo-seq

筛选翻译水平发生变化的RNA分子，研究相应的分子调控机制。

5.5SLAM-seq

筛选稳定性发生变化的RNA分子，研究相应的分子调控机制。

5.6CHIRP-seq

筛选或验证目标RNA与DNA互作，研究相应的分子机制。

 

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CUT&Tag-seq

 

云序生物服务优势

优势一：云序累计支持客户发表数百篇SCI论文，合计影响因子3000 +

优势二：累计完成测序样本数万例，全面覆盖医口、农口等各类样本。

优势三：全面检测mRNA和各类非编码RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。

优势四：提供RNA修饰一站式服务：整体水平检测、RNA修饰研究、MeRIP-qPCR验证、RIP-seq、RNA pull-down、Ribo-seq和SLAM-seq等。

优势五：率先研发超微量MeRIP测序技术，RNA量低至500ng起。

优势六：国内较全的RNA修饰测序平台，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙酰化和2'-O-甲基化、假尿嘧啶等修饰的测序技术。

 

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