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用户文章IF=15.1|余健秀团队再次携手云序,揭示TBK1介导的AGO2磷酸化促进肺癌发生

发布时间:2024-03-27 11:02 |  点击次数:

肺癌,尤其是非小细胞肺癌(NSCLC),仍然是世界范围内死亡的主要原因。虽然先进的治疗方法已经应用于肺癌的治疗,但对于一些非小细胞肺癌患者仍然没有有效的治疗策略。基于RNA的治疗是一个很有前途的领域,近年来引起了人们的广泛关注。例如,miRNA可通过降解靶向mRNA或抑制翻译参与转录后水平的基因表达调控,其中一些致癌miRNA在非小细胞肺癌中高表达,参与肿瘤的发生、发展和转移。在人体内,原代miRNA首先被加工成前体miRNA,进一步被加工成miRNA双链,双链被募集到AGO2上并解链,从而开始形成成熟的miRNA诱导的沉默复合体(miRISC)。然而,成熟miRNA如何装载到AGO2中的详细机制,以及未知的AGO2关键修饰是否参与miRISC的形成和miRNA活性尚不清楚。另外,TBK1(Tank-binding kinase 1)也参与癌症进展,能够通过磷酸化IRF3和IRF7来激活I型IFN和抗病毒免疫,干扰素基因刺激因子(STING)与TBK1结合,该位点位于TBK1的经典激酶激活环内。
 

因此,抗致癌miRNA治疗是一种有潜力且有效的治疗方法,基于miRNA的联合治疗策略有望改善治疗反应,而关键的挑战是探索有效的靶miRNA和组合方法!
 

2024年2月13日,云序客户上海交通大学基础医学院余健秀教授团队在Advanced Science(IF=15.1)上发表了题为“Phosphorylation of AGO2 by TBK1 Promotes the Formation of Oncogenic miRISC in NSCLC”的研究性论文。在此项工作中,作者揭示了由TBK1介导的AGO2磷酸化修饰,通过调节肿瘤细胞中高丰度且具有促癌功能的miRNAs装载形成miRISC复合物,进而影响肿瘤细胞基因表达模式,调控非小细胞肺癌(NSCLC)发生发展的新分子机制。因此,靶向AGO2磷酸化可能为非小细胞肺癌的治疗提供一种潜在的新策略。

云序生物已与该课题组多次进行合作,并携手发表多篇高分文章!
 


本文是云序生物与该课题组合作的“第四篇”高分文章!该研究中的miRNA-Seq、mRNA-Seq、 RIP-Seq等高通量测序技术均由上海云序生物公司提供。
 

下面我们就一起来看看这篇文章的研究思路和成果吧~~
 

文献

标题:Phosphorylation of AGO2 by TBK1 Promotes the Formation of Oncogenic miRISC in NSCLC

发表时间:2024年2月13日

发表期刊:Advanced Science

影响因子:IF=15.1/Q1

研究方法: miRNA-Seq、mRNA-Seq、 RIP-Seq、RIP-qPCR

 

研究摘要
 

非小细胞肺癌(NSCLC)是一种高致死性肿瘤,经常对靶向治疗产生耐药性。研究表明,TBK1磷酸化AGO2的S417位点(pS417-AGO2),通过增加microRNA诱导的沉默复合体(miRISC)的形成促进NSCLC的进展。临床NSCLC标本中高水平的pS417-AGO2与不良预后呈正相关。有趣的是,使用表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂吉非替尼(Gefitinib)治疗可以显著诱导pS417-AGO2,从而增加致癌miRISC的形成和活性,这可能有助于NSCLC对吉非替尼的耐药。在此基础上,提出了两种治疗策略。一种是联合拮抗NSCLC中高表达的多种致癌miRNAs,并使用TBK1抑制剂氨来呫诺(Amlexanox)减少致癌miRISC的形成。另一种方法是吉非替尼联合氨来呫诺抑制吉非替尼耐药NSCLC的进展。这一发现揭示了TBK1介导的pS417-AGO2调控致癌miRISC的新机制,并为非小细胞肺癌的治疗提供了潜在的方法。
 

图文摘要

 

技术路线

公众号研究思路-0325

*红色部分技术服务云序均可提供
 

 

研究结果
 

1、TBK1通过与AGO2直接相互作用,促进miRNA引导的基因沉默
 

为了研究TBK1是否参与miRNA活性的调节,作者将转染GFP-4×miR21-BS质粒的H1299和A549细胞用IL-1β处理指定时间,然后收集细胞进行Western blotting (WB)分析GFP蛋白和pS172TBK1的水平。作者发现pS172-TBK1和miR-21的活性随着时间的推移而平行增加,以响应IL-1β的刺激(图1A,B),表明TBK1可能参与miRNA活性的调节。

因此,作者想知道AGO2是否与TBK1有物理相互作用。HeLa细胞的裂解物与抗TBK1(图1C)或抗AGO2抗体(图1D)进行相互免疫共沉淀实验(Co-IP),然后进行WB分析,显示内源性AGO2确实与TBK1相互作用。为了进一步证实AGO2与TBK1之间的直接相互作用,作者进行GST下拉实验,结果表明TBK1直接与AGO2结合(图1E)。考虑到AGO2是一种RNA结合蛋白,作者进一步证实了这种相互作用是独立于RNA的(图1F)。TBK1与pS172-TBK1一起被脂多糖(LPS)和病原体核酸激活,触发TLR3/4和cGAS-STING信号轴的激活。有趣的是,LPS处理后,HeLa细胞中AGO2与活性形式pS172TBK1的相互作用显著增强(图1G)。

接下来,作者试图探索TBK1是否影响AGO2介导miRNA引导的基因沉默的功能。作者构建了一个失活的TBK1突变体,在172位(S172A)用丙氨酸取代了丝氨酸,这取消了它的自磷酸化和激活。然后作者将miR-21或let-7a模拟物、Myc-AGO2、Flag-TBK1WT或FlagTBK1S172A共转染到HeLa细胞中,然后通过WB分析确定PTEN或HMGA2的表达水平,因为PTEN和HMGA2分别是miR-21和let-7的直接靶点。结果显示,AGO2分别增强了miR-21或let-7a对PTEN或HMGA2表达的抑制作用,TBK1 -WT显著增强了这种抑制作用,TBK1-S172A则没有(图1H)。

此外,作者采用了miR-21或let-7 miRISC荧光素酶报告基因实验,发现AGO2显著增强了对荧光素酶报告基因活性的抑制作用,TBK1-WT能显著增强这种抑制作用,TBK1-S172A则不能(图1I),并进一步证实这一点,得到了类似的结果,GFP表达水平受到AGO2的抑制,TBK1-WT的作用更为明显,TBK1-S172A的作用则不明显(图1J).

为了研究TBK1是否在AGO2介导的基因切片中发挥作用,作者设计了一个含有天然mir -21靶向序列的5 ' -生物素- mir -21靶RNA。将Flag-AGO2与TBK1-WT或TBK1-S172A共转染的293T细胞裂解液与抗flag抗体共转染,然后用3xFlag肽纯化AGO2复合物。生物素-miR-21靶RNA、miR-21双工(图1K)或pre-miR-21(图1L)与/不含AGO2复合物孵育,进行体外靶RNA切片实验。结果表明,在没有AGO2配合物的反应中,没有观察到裂解产物。

综上所述,上述结果表明TBK1直接与AGO2相互作用,并依赖于其激酶活性促进miRNA引导的基因沉默。
 

图1

图1:TBK1直接与AGO2相互作用,促进miRNA引导的基因沉默
 

 

2、TBK1促进miRNA装载到AGO2上,形成有效的miRISC

接下来,作者研究了TBK1通过miRISC调节miRNA介导的基因沉默效率的机制。

成熟miRISC的形成至少涉及两个步骤:将miRNA双链(miRNA/miRNA*)加载到AGO2上,然后解开miRNA双链,AGO2选择miRISC内的引导链。因此,作者首先进行了体外miRNA加载实验,以确定TBK1是否参与了miRNA加载到AGO2上的过程。

TBK1敲除(通过CRISPR-Cas9系统)HeLa细胞的裂解物通过抗AGO2抗体免疫沉淀(IP-ed),然后将蛋白A/G珠与纯化的生物素- mir -21双工共孵育。通过Northern blotting (NB)检测,加载到AGO2上的引导链在TBK1缺乏时显著减少(图2A)。同样,通过使用生物素标记的pre-let-7a-3,成熟的let-7a与AGO2的结合通过TBK1的敲低(与shRNA一起)而显著降低,而通过miRNA的过表达而大大增强。这些结果表明TBK1可以促进miRNA装载到AGO2。

为了进一步研究TBK1的这种作用是否依赖于它的激酶活性,作者使用共转染TBK1-WT或失活突变体TBK1-S172A和Flag-AGO2的293T细胞的裂解物进行了类似的体外miRNA加载实验。在IP中分别添加纯化的生物素- mir -21双工(图2B)和生物素标记的premiR-21(图2C)。通过NB检测装载到AGO2上的引导链/成熟的miR-21,表明TBK1-WT显著增加了成熟的miR-21与AGO2的结合,而TBK1-S172A在体外没有增加(图2B,C)。此外,作者还进行了体内RIP-NB实验,得到了相同的结果,即TBK1缺乏减少(图2D),而TBK1过表达增加了内源性miR-21(图2E)或miR-let-7a加载到miRISC的AGO2中,这需要其激酶活性(图2E)。

为了验证TBK1促进miRISC的形成,将短暂表达Flag-AGO2和TBK1-WT或TBK1-S172A的293T细胞裂解物与链亲和素- dynabeads耦合的生物素化的miR-21双工模拟物一起孵育进行下拉实验,结果显示TBK1-WT显著增加了招募到miR-21模拟物的AGO2(微粒),而TBK1-S172A则没有(图2F)。作者还在体外对miR-21双链模拟物进行了展开实验,结果显示TBK1-WT显著增加了miR-21双链模拟物双链RNA (dsRNA)展开的单链RNA (ssRNA)分子,而TBK1-S172A则没有(图2G),表明TBK1促进了AGO2介导的miRNA双链展开。此外,作者进行了risc捕获试验,其中生物素标记的miR-21靶RNA与293T细胞的细胞裂解液一起孵育,共转染了指定的质粒和miR-21双工模拟物,以拉下活化的成熟miRISC。结果显示,生物素标记的miR-21靶向RNA捕获的AGO2:miRNA复合物被TBK1-WT强烈增强,而TBK1-S172A则没有,这表明TBK1促进了miRISC的形成(图2H)。为了进一步证实TBK1的激酶活性对于miRNA装载和miRISC的形成是特别需要的,作者在实验中引入了具有n端附着肉豆蔻酰化信号的myr-AKT1的组成活性形式。Flag-AGO2与TBK1-WT、TBK1-S172A或TBK1S172A/myr-AKT1共转染至293T细胞。裂解物用于体外miRNA装载实验和生物素化miRNA-链亲和素拉下实验。结果显示,TBK1-WT显著增加了成熟miR21对AGO2的装载,而TBK1S172A、TBK1S172A和myr-AKT均未增加成熟miR21对AGO2的装载。

综上所述,上述结果表明TBK1以激酶依赖的方式促进miRNA加载到AGO2和miRISC的形成。
 

图2

图2:TBK1促进miRNA的装载和miRISC的形成
 

 

3、TBK1磷酸化AGO2的S417位点,增强miRISC的形成和活性

由于TBK1直接与AGO2相互作用,作者推测AGO2是TBK1的底物。为了证实这一点,进行了几次生物化学实验。转染或不转染Flag-TBK1的MycAGO2的293T细胞用抗磷酸化ser /Thr (pS/T)抗体裂解成IP,然后用antiMyc抗体裂解成WB,结果显示TBK1的过表达比载体提高了AGO2的pS/T水平(图3A)。相反,TBK1的敲低降低了HeLa细胞中AGO2的pS/T水平(图3B)。此外,将细菌表达的GST-AGO2蛋白加入到异位表达TBK1的293T细胞或载体的裂解物中孵育过夜,随后用GST珠拉下,用抗ps /T抗体进行免疫印迹,结果表明,与过表达TBK1的293T细胞的裂解物孵育的GST-AGO2蛋白磷酸化水平远高于转染对照载体的细胞(图3C)。体外激酶实验也进行了,其中细菌表达的GST- AGO2和纯化的Flag-TBK1从293T细胞在激酶缓冲液中共孵育反应,随后GST珠拉下,抗ps /T抗体免疫印迹。结果表明TBK1能够在体外催化AGO2磷酸化(图3D)。以上结果表明TBK1是AGO2的新激酶。

为了鉴定TBK1依赖性AGO2磷酸化位点,作者首先使用PhosphoSitePlus程序预测AGO2蛋白的序列QPPS417*ILY是TBK1的高度保守基序。作者已经通过质谱分析证实S417确实被磷酸化。转染了Myc-AGO2WT或点突变体Myc-AGO2S417A的293T细胞用抗pS/T抗体裂解IP,随后用抗myc抗体进行免疫印迹分析,结果显示与AGO2WT相比,AGO2S417A的pS/T水平大大降低(图3E),提示S417是AGO2的磷酸化位点。Phostag SDS-PAGE分析进一步证实了S417是AGO2的一个主要磷酸化位点(图3F)。

为了进一步证实AGO2的pS417在体内确实存在,作者自制了一种针对pS417的抗体(antipS417)。为了表征抗体的特异性,作者进行了点印迹实验,发现抗ps417抗体优先检测磷酸化肽而不是未修饰的肽。

与图3D相同的体外激酶实验显示TBK1催化pS417-AGO2(图3G)。使用自制的AGO2特异性抗ps417抗体,将H358细胞裂解物与抗AGO2抗体进行免疫印迹,再用抗ps417抗体进行免疫印迹,发现可以检测到内源性的pS417-AGO2(图3H)。作者还证实,通过稳定敲低H1299 (H1299- shTBK1)细胞中的TBK1, pS417-AGO2水平显著降低(图3I),而通过在H1299 (H1299-TBK1)细胞中异位表达TBK1, pS417-AGO2水平升高(图3J)。此外,作者检测了不同细胞类型在脂多糖(lipopolaccharides, LPS)作用指定时间后的pS417-AGO2水平,发现LPS刺激后,不同细胞类型的pS417-AGO2水平均被诱导(图3K)。相反,Amlexanox可降低A549(图3L)、H1975和H1299细胞中pS417-AGO2的水平,Amlexanox是TBK1的特异性抑制剂,用于治疗复发性阿弗顿溃疡。综上所述,作者证明了TBK1在体外和体内特异性磷酸化了S417位点的AGO2。

为了确定pS417-AGO2是否参与miRISC的形成和活性,作者进行了4个类似的实验,如图2所示。体外miRNA加载实验显示,与AGO2WT相比,miR-21加载到AGO2S417A的引导链减弱(图3M)。dsRNA展开实验显示,与AGO2WT相比,AGO2S417A减少了miR-21-duplex (dsRNA)形成的miR21-guide (ssRNA)分子(图3N)。生物素化的miRNA-Streptavidin下拉实验显示,与AGO2WT相比,招募到miR-21模拟物的AGO2S417A(微珠中)明显减少(图30)。最后,体外靶RNA切片证明AGO2WT组比AGO2s417aggroup组有更多的裂解产物(图3P)。综上所述,TB磷酸化AGO2的S417位点,增强miRISC的形成和活性。

图3

图3:TBK1磷酸化AGO2位点以增强miRISC的形成和活性
 

 

4、pS417-AGO2促进NSCLC进展

为了探究pS417-AGO2的生物学功能,作者首先用特异性抗ps417抗体检测了不同肺癌细胞系中pS417-AGO2的水平。其中WI38/VA13为正常人肺成纤维细胞系,16HBE为正常人支气管上皮细胞系,其余为NSCLC细胞系。结果显示,NSCLC细胞系中pS417-AGO2的表达水平远高于正常细胞系(图4A)。作者在H358-shAGO2和H1299-shAGO2中产生了稳定的再表达AGO2WT或AGO2S417A,其中内源性AGO2通过慢病毒shRNA系统被沉默。为了探讨pS417-AGO2是否影响细胞转化潜能,作者对稳定的H358细胞系进行了软琼脂集落形成实验。结果表明,内源性AGO2在H358细胞中沉默减少不依赖锚地的菌落形成和生长;通过重新表达AGO2WT而不是突变体AGO2S417A来挽救(图4B)。三维培养实验表明,敲低AGO2可使H1299细胞不再渗透到基质中,而是生长成紧密的菌落。重新表达的AGO2WT细胞弥漫性增殖,形态分散,具有很强的侵袭细胞外基质的能力。相比之下,AGO2S417A细胞生长成致密的圆形集落(图4C)。与这些结果一致的是,异位表达AGO2WT而非AGO2S417A促进了血管源性模仿(VM)的形成(图4D)。为了进一步研究pS417-AGO2是否也在体内影响肿瘤生长,作者将上述稳定的H1299细胞系皮下接种到裸鼠背部进行异种移植肿瘤生长实验。作者拍摄了照片(图4E),并测量了肿瘤的重量(图4F),结果显示,与AGO2WT相比,AGO2S417A组肿瘤的大小和平均重量都减小了。作者已经证实,在AGO2WT异种移植肿瘤中,pS417-AGO2的水平远高于AGO2S417A异种移植肿瘤。

接下来,作者通过WB检测NSCLC标本及其配对的邻近正常组织中pS417-AGO2的水平,发现肿瘤中pS417-AGO2的水平明显高于邻近正常组织。为了进一步支持这一点,作者使用pS417AGO2抗体进行免疫组化染色(IHC),检测非小细胞肺癌组织阵列和肺癌组织阵列中pS417-AGO2的水平,结果显示,肿瘤组织中pS417-AGO2的水平明显高于正常组织(图4H-J)。作者还发现病理亚分期组中pS417-AGO2水平不同。重要的是,pS417-AGO2/AGO2比值在NSCLC样本中显著升高(图4K),且与肿瘤分级呈正相关(图4L)。与观察到的pS417AGO2水平变化相反,AGO2蛋白总体水平保持相对稳定,表明NSCLC与正常组织之间无明显变化。在分析的样本中,83.33%的NSCLC样本显示pS417-AGO2水平升高,5%的病例观察到pS417-AGO2水平下降。相反,在AGO2蛋白水平上,33.33%的NSCLC样本呈上升趋势,53.33%的NSCLC样本呈下降趋势。

综上所述,上述研究结果表明pS417-AGO2促进NSCLC的发展,pS417-AGO2高水平与NSCLC的进展呈正相关,提示pS417-AGO2高水平是NSCLC的危险因素,可能是潜在的治疗靶点。

图4

图4:AGO2在S417位点的磷酸化促进了NSCLC的进展
 

 

5、在NSCLC中,pS417-AGO2促进高丰度致癌miRNAs进入AGO2

为了探究pS417-AGO2对miRNA通路的全局影响,作者对上述稳定细胞H1299-shAGO2-Flag-AGO2WT和H1299-shAGO2Flag-AGO2S417A进行了miRNA-Seq、AGO2 - RIP-SeqmRNA-Seq三个高通量测序。基于miRNA-Seq,对miRNA谱进行分析,发现AGO2WT和AGO2S417A之间有少量miRNA发生了变化。AGO2 - RIP-Seq结果显示,通过累积分布曲线(图5A)和密度分布图(图5B)分析,与AGO2S417A相关的miRNA较与AGO2WT相关的miRNA明显减少。

根据与AGO2S417A和AGO2WT的结合能力,作者将miRNA分为低亲和组(RIP下调富集,log2 [fold change] < 0.5, RIP/input≥1)和高亲和组(RIP上调,log2 [fold change]≥0.5,RIP/input≥1)。分布图分析显示,低亲和组的miRNA多于高亲和组(图5C)。可能需要pS417-AGO2来装载参与细胞增殖、耐药、免疫反应和自噬调控的关键miRNA,如miRNA-21、miR-155、miR-17和miR-221(图5C)。综合分析上述AGO2 - RIP-SeqmiRNA-Seq数据,作者发现H1299细胞中丰度排名前10位的miRNA所占比例约为92%。最丰富的五个miRNA,包括miR-100-5p、miR-148-3p、miR-10a-5p、miR-24-3p和miR21-5p,属于低亲和力组(图5D),最重要的是,它们是致癌miRNA。与AGO2WT相比,最丰富的miRNA对AGO2S417A的亲和力显著降低(图5E)。为了进一步证实这一点,作者通过RIP-qRT-PCR显示,最丰富的内源性miRNA,包括miR100-5p、miR-148-3p、miR-10a-5p、miR-24-3p、miR-21-5p和miR-9-5p,与AGO2S417A的结合水平明显低于与AGO2WT的结合水平(图5F)。

为了确定pS417-AGO2转录后调控的基因表达,根据log2 [fold change]≥0.5(上调)或log2 [fold change] < 0.5(下调)的标准筛选mRNA-Seq的差异表达基因(DEGs)。与AGO2WT组相比,作者在AGO2S417A组中发现了2210个上调转录本和1743个下调转录本。作者进一步探讨了pS417-AGO2对靶mRNA水平的影响。选择TargetScan、miRTarBase和miRDB三种生物信息学工具同时预测的miRNA靶标进行累积分数分析,结果显示AGO2S417A组中低富集miRNA靶标比AGO2WT组中更丰富(图5H)。同样,AGO2S417A组前10个富集miRNA的靶mRNA水平也远高于AGO2WT组(图5I)。上述结果表明,pS417-AGO2促进了高丰度的致癌miRNA加载到AGO2中,促进了NSCLC细胞中靶mRNA的降解和翻译抑制。

为了进一步揭示miRNA靶点的生物学作用,作者对KEGG/Canonical Pathways和Hallmark/Reactome Gene Sets进行了功能富集分析,发现前10个miRNA靶点富集于癌症相关通路,如癌症、细胞周期、细胞凋亡等通路(图5J,K)。综合富集分析发现,前10位miRNA的靶点主要参与肿瘤发生发展的调控(图5L)。此外,作者还对AGO2S417A和AGO2WT组之间的DEGs进行了KEGG/Canonical Pathways和Hallmark/Reactome Gene Sets的功能富集分析,结果显示,DEGs也富集于癌症相关通路,如癌症通路、细胞-细胞外基质(ECM)相互作用、细胞周期。此外,基因本体(Gene Ontology, GO)分析显示,在细胞外基质结合、细胞粘附调控等不同的基因簇中富集了DEGs。综合富集分析显示,pS417-AGO2调控的DEGs也参与了癌症通路,这与前10名miRNA靶点的功能特性高度一致(图5L)。

为了评估前10个miRNA靶点与pS417-AGO2调控的deg之间的交叉,作者对miRNA靶点和DEG进行了综合分析。Circos图显示了前10个miRNA靶点和DEG之间的部分重叠,表明两个数据集中的通路趋同。为了全面比较重要的途径,作者使用Metascape对miRNA靶点和DEGs进行了途径富集分析,以进行Meta分析。结果表明,miRNA靶点和DEGs之间的富集通路存在大量重叠(图5M)。

综上所述,这些结果表明p417-AGO2主要通过增加miRISC的形成来调节基因表达谱。

图5

图5:AGO2在S417位点的磷酸化促进了NSCLC的进展
 

 

6、联合拮抗致癌miRNAs和减少致癌miRISC的形成来治疗NSCLC

作者发现,在非小细胞肺癌中,将高度丰富的致癌miRNA装载到AGO2中形成miRISC的数量增加,这表明干预或减少这些致癌miRISC的形成可能是一种很有希望的抗肿瘤治疗策略。确定每种疾病类型的最佳miRNA候选物或靶点仍然是开发基于miRNA的治疗方法的重大挑战。结合作者的RIP-Seq数据,作者进一步分析了TCGA (the Cancer Genome Atlas)数据库中30种肿瘤类型的miRNA-Seq数据,以找到高丰度的miRNA。为了开发一种新的基于miRNA的非小细胞肺癌治疗策略,作者通过单变量cox分析筛选了最佳的miRNA组合。作者使用一组以miR-21为中心的高丰度miRNA进行了多靶点组合分析。单因素cox分析显示,miR-21、miR-9和miR-10b联合治疗是最有效的治疗策略(图6A)。通过分析公开的临床数据,作者发现在临床大样本NSCLC病例中miR-21、miR-9和miR-10b的表达水平显著升高与配对正常组织相比(GEO数据库GSE137140),Kaplan-Meier生存分析显示,miR-21、miR-9或miR-10b高水平的患者在多种肿瘤中的生存率较低(图6B)。作者还通过IP - NB检测了miR-21、miR-9和miR-10b在异种移植肿瘤中的装载(图4E),结果表明,这三种miRNA在AGO2WT组的异种移植肿瘤中的装载均高于AGO2S417A组(图6C),表明它们的功能受到pS417-AGO2的调控。

为了探索选定的miRNA在NSCLC中的作用,使用合成miRNA拮抗剂的拮抗剂进行集落形成试验。通过使用三种类型的拮抗剂分别抑制miR-21、miR-9和miR-10b,菌落数量明显减少,而加入TBK1抑制剂Amlexanox进一步增强了对H1299和A549细胞的抑制作用(图6D,E)。这一结果表明,除了这三种抗他高药物外,Amlexanox还通过抑制pS417-AGO2水平干扰致癌miRISC的形成,从而发挥增强的协同抑制作用。

为了进一步了解上述策略的体内治疗效果,作者将H1299细胞皮下注射到裸鼠体内。发现与antagomiR(NC)相比,antagomiR(21)治疗可显著减小肿瘤大小(图6F、G)和重量(图6H)。更重要的是,antagomiRs(21+9+10b)对肿瘤生长的抑制作用比antagomiR(21)更明显,表明多靶点策略对致癌miRNAs的抑制作用优于单靶点策略。

此外,为了研究antagomiRs和Amlexanox在体内的联合治疗效果,小鼠腹腔注射Amlexanox(25 mg k−1 g),每周2次。与单用Amlexanox相比,Amlexanox与Amlexanox联合治疗(21+9+10b)对肿瘤生长的抑制作用最大(图6F-H)。这些结果表明,联合拮抗致癌性miRNA和Amlexanox降低致癌性miRISC形成的治疗策略为发展基于miRNA的非小细胞肺癌治疗提供了有效途径。

图6

图6:联合拮抗致癌miRNAs和减少致癌miRISC的形成来治疗NSCLC
 

7、吉非替尼联合氨来呫诺治疗耐药NSCLC

尽管EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)为晚期NSCLC患者提供了一种有效的治疗方法,但克服NSCLC患者对EGFR-TKIs获得性耐药的治疗策略仍有待确定。

有趣的是,作者发现EGFR的第一选择性TKI吉非替尼在H1299-shAGO2-AGO2WT中显著增加(图7A), miR-21和miR-10b(图7B)在AGO2上的装载,而在H1299-shAGO2-AGO2S417A细胞中没有。更重要的是,在H1299-Flag-AGO2细胞中,添加氨来呫诺可以抑制吉非替尼诱导的pS417-AGO2(图7C)。因此,吉非替尼治疗增加了三种致癌miRNA miR-21、miR-10b和miR-9在AGO2中的负荷,而与氨来呫诺共治疗显著降低了这一载量(图7D)。不同NSCLC细胞中pS417-AGO2水平差异显著。值得注意的是,结果显示PC9和HCC827中的pS417AGO2水平明显低于PC9/GR(吉非替尼获得性耐药)、HCC827/GR(吉非替尼获得性耐药)和其他细胞。PC9和HCC827细胞的区别在于EGFR外显子19缺失突变的存在,这使得它们对EGFR- tkis有明显的反应。长时间暴露于吉非替尼后,从其亲本敏感细胞株PC9和HCC827中建立PC9/GR和HCC827/GR细胞。H1299和H1975细胞对吉非替尼也相对不敏感。氨来呫诺治疗降低了PC9/GR细胞和HCC827/GR细胞中的pS417-AGO2水平。与亲代PC9和HCC827细胞相比,PC9/GR和HCC827/GR细胞对吉非替尼的耐药性明显增强。由于吉非替尼通过TBK1介导的pS417-AGO2增强了致癌miRISCs的形成和活性,这可能有助于吉非替尼获得性耐药,作者推测与氨lexanox联合治疗可能克服吉非替尼耐药。因此,作者比较了单药氨来呫诺或吉非替尼与双药联合对PC9/GR、HCC827/GR、H1299和H1975细胞生长的抑制作用。氨来呫诺与吉非替尼联用显著增强了对PC9/GR(图7E)、H1975(图7F)、HCC827/GR、H1299细胞生长的抑制作用。

接下来,作者探讨了吉非替尼和氨来呫诺联合治疗耐药NSCLC的体内治疗策略。作者使用PC9/GR细胞进行体内实验。作者比较了使用较低剂量的吉非替尼(20mg k−1g)和氨来呫诺(20mg k−1g)在PC9/GR细胞中建立的肿瘤中的治疗效果。裸鼠皮下注射PC9/GR细胞。两周后,小鼠灌胃吉非替尼,腹腔注射/不注射氨来呫诺。结果显示,与吉非替尼或氨来呫诺单药治疗相比,双药联合治疗肿瘤消退明显(图7G-K)。与载药组和单药组相比,联合治疗组肿瘤的平均大小(图7I,J)和重量(图7K)均有显著降低。

吉非替尼和氨lexanox联合治疗可显著抑制肿瘤生长,且体重没有明显下降(图7L)。与体内PC9/GR细胞的实验结果一致,双药联合治疗比吉非替尼治疗更有效地抑制肿瘤生长,且体重没有明显下降。

综上所述,这些结果表明,致癌miRNA装载部分促成了EGFR-TKI耐药,与氨来呫诺联合治疗是克服NSCLC EGFR-TKI耐药的一种特别有效的方法。

图7

图7:吉非替尼联合氨来呫诺治疗耐药NSCLC
 

 

全文小结

  • 本研究中发现TBK1是一种新的激酶,可以磷酸化AGO2的S417位点,并且可以被EGFR-TKI吉非替尼药物诱导。

  • 高水平的pS417-AGO2通过增加致癌miRISCs的形成和活性,促进非小细胞肺癌的进展和对吉非替尼的耐药。

  • 临床标本中高水平的pS417-AGO2与肺癌患者预后不良呈正相关,是非小细胞肺癌的高危因素之一,提示pS417-AGO2水平的测定可能成为临床新的诊断指标。

  • 揭示了使用TBK1抑制剂氨来呫诺降低pS417-AGO2是治疗非小细胞肺癌的一个好策略,为非小细胞肺癌的治疗提供了潜在的方法。
     

 

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