迄今为止，已发现了170多种RNA修饰方式，主要包括N6-甲基腺苷（m6A）、N1甲基腺苷（m1A）、5-甲基胞嘧啶（m5C）、N7-甲基鸟苷（m7G）、N4-乙酰胞嘧啶（ac4C）、N6,2'-二甲基腺苷（m6Am）和假尿嘧啶（Ψ）等碱基修饰。这些修饰在真核生物的mRNA中非常普遍，它们的发现也促使表观转录组学成为一个研究领域。目前，在这些RNA修饰当中最被广为研究的是m6A，但近2-3年来，m6Am、m1A、m5C、hm5C、ac4C、Ψ和m7 G等也被大家广泛关注。

今天我们详细来介绍一下其中四种RNA修饰研究的多组学方案：m6A、m7G、m5C、ac4C。首先先介绍一下这四类RNA修饰以及它们的功能：
 

1、N6-甲基腺苷（m6A）：

RNA甲基化修饰约占所有RNA修饰的60%以上，而m6A是高等生物mRNA和lncRNAs上最为普遍的修饰，是指在RNA分子中，特别是在mRNA中，腺苷（A）的第六位碳上的氮原子N6的位置上加上甲基（-CH3）的化学修饰，是转录后修饰的一种形式。

目前发现microRNA、circRNA、rRNA、tRNA和snoRNA上都有发生m6A修饰。m6A修饰主要发生在RRACH序列中的腺嘌呤上，其功能由甲基转移酶Writer、去甲基化转移酶Eraser和甲基化识别蛋白Reader决定。目前已知Writer有METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1429；ALKBH5和FTO作为Eraser可逆转甲基化；Reader有YTH结构域蛋白（包括YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1和YTHDC2）和核不均一蛋白HNRNP家族（HNRNPA2B1和HNRNPC）。

m6A修饰几乎涉及RNA代谢的所有方面。如m6A RNA甲基化可调控多种组蛋白修饰，影响基因的表达；m6A也参与了异染色质的形成和维持，其在RNA上的沉积可以改变局部RNA的二级结构，从而影响细胞中RNA-蛋白质相互作用。m6A修饰还可以影响pri-miRNA和pre-miRNA的剪接和成熟，从而影响miRNA的功能。m6A修饰还可通过多种机制调控mRNA翻译为蛋白质。目前m6A与常见肿瘤疾病已经有了很多报道，在其他非肿瘤疾病当中尚还有不少有待于进一步研究。
 

2、N7 -甲基鸟苷（m7 G）：

m7G是转录后调控中常见的碱基修饰之一，近两年中标数量逐渐增多但又没有泛滥，m7G修饰通过影响RNA分子的代谢，参与人体中多种生理和病理功能。

m7G广泛分布于tRNA、rRNA以及真核生物mRNA的5’帽子区，不同类型的RNA的内部m7G修饰具有不同的功能。其中，tRNA m7G修饰是研究最深入的一个：m7G修饰对tRNA表达、结构稳定和功能具有重要作用。如m7G修饰可以稳定tRNA的tRNA三维核心；提高tRNA解码密码子依赖的方式中mRNA的翻译效率以及调节核糖体易位等。在mRNA和pri-miRNA上，m7G修饰表现出与tRNA不同的功能。如稳定mRNA并刺激其翻译，或直接增强mRNA的翻译等。

目前，对m7G修饰的调节因子的了解仍处于初步阶段。哺乳动物中m7G甲基转移酶主要是METTL1/WDR4、WBSCR22/TRMT112以及RNMT/RAM。研究证明，m7G参与调控多种疾病，如异常干细胞生长和分化、Galloway Mowat综合征、侏儒症等，在肿瘤及神经退行性疾病中也发挥重要作用。m7G甲基转移酶通常在癌症中异常表达，最终影响靶基因表达并调节肿瘤相关的生物学功能。同时，m7G还能调节细胞周期蛋白，影响癌症进展。
 

3、5-甲基胞嘧啶（m5C）：

m5C修饰是指供体的一个活性甲基被添加到RNA中胞嘧啶碱基的第5位碳，它是一种广泛存在的RNA修饰，在mRNA和非编码RNA中都有检测到，包括tRNA、rRNA、snRNA和eRNA等。m5C在近几年中标数量逐年升高，且还处于爬升阶段，妥妥的潜力新星！

目前已经发现了10多种类型的RNA m5C甲基转移酶Writer，包括DNMT2、TRDMT家族成员、NSUN家族（包括NSUN1到NSUN7和NSUN5a/b/c）。DNMT2和NSUN2具有互补的靶点特性。蛋白质去甲基化酶Easear（如TET酶家族）通过介导RNA的去甲基化使其具有可逆性。RNA m5C结合蛋白Reader可通过识别并结合m5 C位点发挥生物学效应，如ALYREF是细胞核中识别的第一个mRNA阅读蛋白，具有K171的关键m5C识别位点。m5C通过在细胞核中的病毒RNA转录本被m5C阅读蛋白ALYREF识别，这有助于其输出到细胞质；YBX1在人细胞中被鉴定为细胞质m5C阅读蛋白，专门靶向几种含有m5C的致癌基因，如HDGF，并促进这些致癌基因的稳定性和癌症进展。87.8%的m5C修饰的mRNA被YBX1识别。

m5C修饰与mRNA的稳定性、剪接和核浆转运；DNA损伤修复；增殖和迁移；干细胞的发育、分化和重编程有关。异常的mRNA m5C修饰与多种疾病的病因有关，包括动脉硬化、自身免疫性疾病和癌症。在tRNA中，m5C可以维持稳态，优化密码子-反密码子配对，调节应激反应，并控制翻译效率。
 

4、N4-乙酰胞嘧啶（ac4C）：

ac4C RNA乙酰化修饰是众多RNA修饰的一种，它的修饰丰度比m6A甲基化修饰要低很多，可能比m6A甲基化修饰低10倍左右，大概只有几万分之一，所以对于ac4C乙酰化的检测要比m6A甲基化难度要高许多。

ac4C乙酰化修饰最早在rRNA及tRNA中报道，广泛分布于从古细菌到真核生物，作为RNA的转录后化学修饰，主要富集在CDS区，5’UTR和3’UTR区也有少量分布。酵母Kre33和人类NAT10是ac4C目前已知的Writer，关于ac4C的其他催化酶及特异性RBP尚未有报道。其中，NAT10同时具有乙酰化催化功能及RNA结合活性。NAT10（N-乙酰转移酶10）催化的mRNA上的ac4C与多种人类疾病，特别是癌症有关。

ac4C在mRNA翻译调控中具有重要影响。如ac4C RNA修饰可以稳定tRNA的结构，能够通过延长mRNA的半衰期并促进mRNA的稳定性。同时，ac4C还能通过影响tRNA选择进而调控mRNA的翻译，有助于特定核苷酸序列的正确读取，稳定mRNA并提高转录效率等。ac4C-RNA乙酰化修饰可能是继m6A RNA甲基化修饰以后另一个研究热点。

除了以上作用机制，RNA修饰还有很多不为人知的功能在等待研究者们的发现。今天我们就来看几篇相关的多组学文章，学习一下他们是如何利用多组学分析工具进行RNA修饰及关键分子功能的研究与探讨的。
 

1、m6A RNA修饰多组学案例

期刊：Journal of hepatology        IF=25.7       

发表日期：2023/7/15  

论文题目：Targeting N6-methyladenosine reader YTHDF1 with siRNA boosts antitumor immunity in NASH-HCC by inhibiting EZH2-IL-6 axis

测序技术：m6A-MeRIP-seq、RNA-seq、RIP-seq、Ribo-seq（云序生物可提供以上服务）
 

 

m6A RNA修饰的Reader蛋白YTHDF1与癌症有关；然而，其在肝细胞癌（HCC）中的作用，特别是在非酒精性脂肪肝炎导致的肝细胞癌（NASH-HCC）中仍不清楚，缺乏有效的靶向药物对NASH-HCC进行治疗。作者通过对YTHDF1肝细胞特异性过表达小鼠以及饮食模型诱导的NASH-HCC自发成瘤模型，通过RNA-seq、m6A-MeRIP-seq、YTHDF1-RIP-seq、蛋白质质谱和Ribo-seq，对YTHDF1的分子靶点进行了阐明。结果发现，自发性NASH-HCC饮食模型中肝脏特异性YTHDF1过表达驱动肿瘤发生。单细胞RNA测序和流式细胞术显示，YTHDF1诱导髓源性抑制细胞（MDSCs）积累，抑制细胞毒性CD8+T细胞功能。机制上，YTHDF1在NASH-HCC细胞中的表达诱导IL-6的分泌，IL-6介导MDSC的募集和激活，导致CD8+T细胞功能障碍。EZH2 mRNA被鉴定为YTHDF1的关键靶点。YTHDF1结合m6A修饰的EZH2 mRNA，促进EZH2翻译。EZH2反过来增加IL-6的表达和分泌。YTHDF1敲除与抗PD-1治疗协同抑制NASH-HCC同种异体移植物的肿瘤生长。此外，使用小干扰RNA靶向治疗YTHDF1可显著提高NASH-HCC同种异体移植物抗PD-1阻断的疗效。研究结果为增强免疫检查点阻断在NASH-HCC中的疗效提供了新的治疗靶点，并为开发用于治疗NASH-HCC的YTHDF1抑制剂提供了理论依据。
 

2、m7G RNA修饰多组学案例

期刊：Nature Communications       IF=16.6     

发表日期：2022/5/18

论文题目：N7-methylguanosine tRNA modification promotes esophageal squamous cell carcinoma tumorigenesis via the RPTOR/ULK1/autophagy axis

测序技术：TRAC-seq、tRNA-seq、Ribo-seq、mRNA-seq（云序生物可提供以上服务）
 

错误调节的RNA修饰会促进致癌mRNA的加工和翻译，从而促进了癌症的进展，而其分子机制尚不清楚。本研究通过TRAC-seq、tRNA-seq、Ribo-seq、mRNA-seq等技术发现，tRNA m7G甲基转移酶复合物蛋白METTL1和WDR4在食管鳞状细胞癌（ESCC）组织中显著上调，并与ESCC不良预后相关。此外，METTL1和WDR4在体外和体内通过tRNA m7G甲基转移酶活性促进ESCC进展。从机制上讲，METTL1或WDR4敲低可导致m7G修饰tRNA的表达减少，并减少富含RPTOR/ULK1/自噬途径的致癌转录本子集的翻译。此外，使用Mettl1的ESCC模型条件性敲除和敲入小鼠揭示了METTL1在体内促进 ESCC 肿瘤发生中的基本功能。研究证明了在ESCC中错误调节的tRNA m 7 G修饰的重要致癌功能，并表明靶向METTL1及其下游信号轴可能是ESCC治疗的有前途的治疗靶点。

 

3、m5C RNA修饰多组学案例

期刊：Clinical and Translational Medicine    IF=10.4    

发表日期：2023/11/13  

论文题目：The m5C methyltransferase NSUN2 promotes codon-dependent oncogenic translation by stabilising tRNA in anaplastic thyroid cancer

测序技术：LC/MS、m5C tRNA Bis-seq、tRNA-seq、Ribo-seq、mRNA-seq（云序生物可提供以上服务）
 

 

翻译失调在肿瘤发生和癌症进展中起着至关重要的作用。致癌翻译依赖于蛋白质合成trna的稳定性和可用性，使其成为癌症治疗的潜在靶点。本研究通过LC/MS、m5C tRNA Bis-seq、tRNA-seq、Ribo-seq、mRNA-seq等技术，发现tRNA m5c甲基转移酶NSUN2在ATC中上调，并与去分化有关。在体内和体外，NSUN2敲低抑制ATC的形成、增殖、侵袭和迁移。此外，NSUN2的抑制增强了ATC对基因毒性药物的敏感性。机制上，NSUN2催化tRNA结构相关的m5c修饰，提高tRNA的稳定性，维持体内平衡并快速运输氨基酸，特别是亮氨酸。这种稳定的tRNA具有显著提高的效率，可以支持包括c-Myc、BCL2、RAB31、JUNB和TRAF2在内的促癌翻译程序。此外，NSUN2介导的m5C水平和不同tRNA Leu同源解码器家族的变化部分促成了密码子依赖性翻译偏差。令人惊讶的是，靶向NSUN2破坏了ATC中c-Myc到NSUN2的周期。本研究揭示了促肿瘤m5C甲基转移酶、动态tRNA稳定性调控和下游癌基因c-Myc引发了一个密码子依赖的致癌翻译网络，促进了ATC的生长和形成。此外，它还为靶向癌细胞的翻译重编程提供了新的机会。
 

4、ac4C RNA乙酰化多组学案例

期刊：Circulation Research          IF=20.1           

发表日期：2023/11/13

论文题目：NAT10 Is Involved in Cardiac Remodeling Through ac4C-Mediated Transcriptomic Regulation

测序技术：acRIP-seq、mRNA-seq、Ribo-seq、SLAM-seq（云序生物可提供以上服务）
 

 

心力衰竭以心脏重塑为特征，与异常的表观遗传过程和异常的基因表达有关。本文章旨在阐明NAT10 （N-乙酰基转移酶10）介导的N4-乙酰胞苷（ac4C）乙酰化在心脏重构中的作用和机制。研究检测了NAT10和ac4C在心脏重构的人和小鼠中的表达。随后，采用acRIP-seq、mRNA-seq、Ribo-seq、SLAM-seq来阐明ac4c修饰的转录后调控在心脏重构中的作用。此外，在AngII（血管紧张素II）和主动脉横断面收缩小鼠模型中进行了涉及NAT10过表达或敲低的功能实验。结果发现，在体外和体内心脏重构模型以及心肌肥厚患者中，NAT10表达和RNA ac4C水平均升高。沉默和抑制NAT10可减轻AngII诱导的心肌细胞肥大和成纤维细胞活化。心肌肥厚小鼠和人类的ac4C变化与mRNA的丰度、稳定性和翻译效率的变化有关。机制上，NAT10可通过上调CD47和ROCK2转录本mRNA ac4C修饰，提高其稳定性和翻译效率，从而导致其在心脏重构过程中的蛋白表达增加。此外，研究表明，通过抑制心脏纤维化、肥厚和炎症反应，给药Remodelin（一种NAT10抑制剂）可以预防横断主动脉收缩小鼠的心功能损伤，同时还可以调节CD47和ROCK2（Rho相关的含卷曲卷曲蛋白激酶2）的表达水平。结论表明，通过NAT10调节表观转录组过程，如ac4C乙酰化，可能是一个有希望的治疗心脏重构的靶点。
 

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