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云序客户 IF=8.3|血清eccDNA测序助力T2DM糖尿病生物标志物新发现

发布时间:2024-02-19 14:47 |  点击次数:

染色体外环状DNA ( eccDNAs )存在于人体血液和体细胞中,是癌基因可塑性和耐药性所必需的。2型糖尿病( type 2 diabetes mellitus,T2DM )是一种严重的、复杂的慢性疾病,以高血糖和胰岛素抵抗为特征。然而,eccDNAs在2型糖尿病( type 2 diabetes mellitus,T2DM )中的存在和影响尚不清楚。

2024年1月,云序客户皖南医学院弋矶山医院吕坤教授课题组在《Cellular & Molecular Biology Letters》以“Increased serum extrachromosomal circular DNA SORBS1circle level isassociated with insulin resistance in patients with newly diagnosed type 2 diabetes mellitus.”为题发表论文,通过eccDNA-seq等测序技术发现新诊断2型糖尿病患者血清eccDNA SORBS1水平升高与患者胰岛素抵抗相关,为糖尿病生物标志物发现提供新思路。
 


 

标题:Increased serum extrachromosomal circular DNA SORBS1circle level isassociated with insulin resistance in patients withnewly diagnosed type 2 diabetes mellitus.(血清eccDNA SORBS1circle 水平升高与新诊断的 2 型糖尿病患者的胰岛素抵抗相关)

发表时间:2024/1/12

发表期刊:Cellular & Molecular Biology Letters

影响因子:IF=8.3/Q1

研究方法:eccDNA-seq、eccDNA-qPCR、sanger测序

研究摘要

染色体外的环状DNA ( eccDNAs )存在于人体血液和体细胞中,是癌基因可塑性和耐药性所必需的。然而,eccDNAs在2型糖尿病( type 2 diabetes mellitus,T2DM )中的存在和影响尚不清楚。作者对新诊断的T2DM患者和正常对照( normal control,NC )受试者的血清eccDNA进行了环状DNA测序(eccDNA-seq),在新诊断的T2DM患者中发现一种新型eccDNASORBS1circle的表达水平显著上调,并与胰岛素抵抗相关。同时作者在高糖高脂( HG / PA )诱导的肝细胞( HepG2细胞)胰岛素抵抗模型中,发现细胞内eccDNA SORBS1circle表达显著增强,而且eccDNA SORBS1circle的上调依赖于凋亡DNA片段的产生。这些结果使我们对T2DM早期体液循环ecc DNA特征与来源有了初步的认识,提示eccDNA SORBS1circle可能参与了胰岛素抵抗的发生发展,为糖尿病生物标志物发现提供新思路。

技术路线


 

研究结果

(1)新诊断T2DM患者血清中的eccDNAs分布特征

为了检测人类基因组中相似配对区域的eccDNA,作者通过血清eccDNA-seq测序技术,使用Circle Map软件,以split reads≥1为筛选条件,进行eccDNA的识别。结果在新诊断的T2DM患者和NC受试者的血清样本中分别发现了22543和19195个eccDNA。T2DM患者血清eccDNAs平均含量高于NC受试者( 8090±904 vs.6462±879 , P < 0.05)。识别到的eccDNA分布于各个染色体,特别是在1号和2号染色体中分布较多。T2DM患者1、14、16、17、18、19、20号和 X 染色体上的 eccDNA 分布更多(与NC受试者相比增加20%以上,图1A),eccDNA的长度差异很大,但大多数eccDNA片段在100-150 bp之间(图1B,C)。
 


 

图1 在新诊断的 T2DM 患者和 NC 受试者的血清中检测到的eccDNA的特征。

A.eccDNA染色体分布特征。B,C.eccDNAs的长度密度分布特征

(2)eccDNAs表达分析与验证

根据表达谱数据,与NC受试者相比,新诊断的T2DM患者血清eccDNA中有1454个显著失调(倍数变化≥2.0,P < 0.05):598个上调,856个下调(图2A)。T2DM患者中前42个上调eccDNA如图2B所示。在上调eccDNA中随机选择5个,通过eccDNA-qPCR验证eccDNA表达水平。如图2C PCR结果显示,新诊断的T2DM患者血清中这5种eccDNA的表达水平升高,与eccDNAs测序数据中观察到的趋势一致。为了进一步探索上调的eccDNAs在T2DM患者中的潜在功能,对eccDNAs携带的基因进行KEGG通路分析,发现与NC受试者相比,T2DM患者eccDNA上的基因在磷脂酰肌醇信号系统中特别富集(图2D),而磷脂酰肌醇信号系统在胰岛素抵抗中起重要作用。
 


 

图2. eccDNA测序数据图谱。

A.新诊断的T2DM患者和NC受试者血清中差异表达的eccDNA的火山图。

B.与NC受试者相比,T2DM 患者中前42个上调eccDNA。

C.随机选择5个上调的eccDNA进行qPCR和外向引物的验证。

D.基于T2DM患者携带基因的eccDNA 的前10个最丰富的KEGG通路。
 

(3)新诊断的T2DM患者血清eccDNA SORBS1circle水平升高

作者选择了显著上调的eccDNA SORBS1circle(根据其染色体来源SORBS1命名)进行进一步研究。通过Sanger测序证实了eccDNA SORBS1circle的环状结构和连接位点(图3A),eccDNA SORBS1circle的凝胶电泳图像如图3B所示。接下来,作者验证了eccDNA SORBS1circle在106名新诊断的T2DM患者和40名NC受试者血清中的表达水平,并证实其含量在T2DM患者中显著增加(倍数变化:4.27,图3C)。此外,作者还评估了血清eccDNA SORBS1circle的诊断价值,发现其对新诊断的T2DM患者和NC受试者患者的ROC曲线下面积 (AUC)为0.959(95% CI 0.93–0.98),敏感性为88.0%,特异性为92.0%(图3D)。
 


 

图3新诊断的 T2DM 患者血清eccDNA SORBS1circle水平升高。

A.最显著上调的血清eccDNA SORBS1circle的可视化图,eccDNA SORBS1circle的连接位点为TCTG。

B.血清 eccDNA SORBS1circle的凝胶电泳图。

C.血清eccDNA SORBS1circle的qPCR验证(106名新诊断的T2DM患者和40名NC受试者表达水平)。**P < 0.01。D.区分 T2DM 患者和 NC 受试者的血清eccDNA SORBS1circle的ROC曲线。
 

(4)新诊断的 T2DM 患者血清eccDNA SORBS1circle水平与的胰岛素抵抗相关

如表所示,相关性分析表明eccDNA SORBS1circle水平与血清FBG(R=0.351,p<0.01)、HbA1c(R=0.257,p<0.01)、FIns(R=0.629,p<0.01)和HOMA-IR(R=0.751,p<0.01)含量呈正相关。在以血清eccDNA SORBS1circle为因变量,FBG、2hPBG、HbA1c、FIns、HOMA-IR和HOMA-β为自变量的多元回归模型中,HbA1c和HOMA-IR是eccDNA SORBS1circle含量的独立预测因子(表2)。在另一个模型中,作者将所有临床和生化因素作为自变量,结果也表明HbA1c 和 HOMA-IR 与血清eccDNA SORBS1circle有独立且显著的相关性。
 


 

表 血清eccDNA SORBS1circle水平与其他临床和生化指标的的相关性及回归分析

*P < 0.05,**P< 0.01。BMI体重指数、SBP收缩压、DBP舒张压、FBG空腹血糖、2hPBG 餐后2h血糖、HbA1c糖化血红蛋白A1c、FIns空腹胰岛素、2hPlns餐后2 h胰岛素、HOMA-IR胰岛素抵抗的稳态模型评估、胰岛β细胞功能的HOMA-β平衡模型评估、TC总胆固醇、TG甘油三酯、HDL-C高密度脂蛋白胆固醇、LDL-C低密度脂蛋白胆固醇、ALT丙氨酸转氨酶、AST天冬氨酸转氨酶、Cr肌酐、UA尿酸
 

(5)HG/PA 处理的HepG2细胞中eccDNA SORBS1circle水平升高

胰岛素抵抗是T2DM发病机制中的一个重要病理生理事件。在T2DM发病过程中,胰岛素抵抗和糖代谢受损经常出现在肝组织中。Akt 是参与胰岛素信号通路的关键信号分子。在胰岛素抵抗的情况下,Akt的磷酸化会受损。因此,作者测定了HG/PA 诱导的 HepG2 细胞胰岛素抵抗模型中eccDNA SORBS1circle的表达,该模型特征是 P-Akt/T-Akt 比值显著下降 (图4A,B)。通过qPCR测定细胞内eccDNA SORBS1circle水平在用HG / PA处理24或36小时的HepG2细胞中显著增加(图4C)。使用Cy3标记的探针进行FISH检测eccDNA SORBS1circle,结果显示HG/PA处理36h后,HepG2细胞中eccDNA SORBS1circle的水平升高。
 


 

图4 HG/PA处理的 HepG2 细胞中eccDNA SORBS1circle的表达。

A,B WB检测25.0 mM葡萄糖(HG)和0.5 mM棕榈酸酯(PA)处理的HepG2细胞中P-Akt S473和T-AKT的蛋白水平,这些HepG2细胞在收获前用100nM胰岛素处理20分钟。

C.qPCR检测HG/PA处理的HepG2细胞内eccDNA SORBS1circle的水平。

D.使用FISH检测在对照和 HG/PA处理的HepG2 细胞中eccDNA SORBS1circle水平
 

(6)经HG/PA 处理的HepG2细胞中eccDNA SORBS1circle水平的升高与凋亡DNA断裂有关

eccDNA通过寡核核糖体DNA片段的随机连接产生,凋亡DNA分子在琼脂糖凝胶图呈现弥散条带形式中。确定eccDNA SORBS1circle水平的升高是否是由细胞凋亡产生的,将HepG2细胞的eccDNA SORBS1circle水平与HepG2细胞的凋亡水平进行了比较。在Z-VAD-FMK存在或不存在的情况下,分别通过 HG/PA 处理 HepG2 细胞,典型的DNA片段(图5A)和Bax/Bcl-2比值的增加(促凋亡标志物,图5B,C)证实了HG/PA处理成功诱导细胞凋亡。Z-VAD-FMK的处理明显逆转了细胞凋亡水平的增加(图5A-C)。此外,Z-VAD-FMK 显著降低了 eccDNA SORBS1circle在HG/PA处理的HepG2细胞中的水平(图5D)。使用Cy3标记的探针进行 FISH 实验检测eccDNA SORBS1circle。结果表明,Z-VAD-FMK处理后,HG/PA处理的HepG2细胞eccDNA SORBS1circle水平在Z-VAD-FMK处理减少(图5E )。
 


 

图5. HG / PA处理的HepG2细胞中eccDNA SORBS1circle的来源。

D.100 μ M Z‐VAD‐FMK处理或不处理情况下,测定HG / PA刺激HepG2细胞36 h后,检测HepG2细胞中的DNA片段化,Bcl‐2和Bax蛋白表达以及eccDNA SORBS1circle水平。

E.Fish检测eccDNA SORBS1circle水平图像。
 

全文小结

  • 本研究发现新诊断的T2DM患者血清eccDNA含量显著高于NC组,且验证血清eccDNA SORBS1circle水平在疾病组显著上调;

  • 新诊断的 T2DM 患者血清eccDNA SORBS1circle水平与的胰岛素抵抗相关,其产生可能与凋亡DNA有关。

云序生物eccDNA测序

云序生物是国内率先提供环状DNA测序服务的公司,早在2018年已启动了环状DNA测序技术的开发。2019年,云序发布了组织细胞环状 DNA 测序(circle-seq),并成为A&A Bio du家代理(该品牌的环状 DNA 纯化柱被绝大部分环状DNA高分文章采用)。2020年,云序又相继发布了体液样品环状DNA测序及体液样品环状DNA甲基化测序服务,拥有丰富的环状DNA测序产品线。迄今为止,我们已经完成上千例样品的环状DNA测序,积累了丰富的项目经验,样品类型涵盖:组织﹑细胞﹑血清﹑血浆﹑尿液等,物种涵盖:人﹑小鼠﹑大鼠﹑拟南芥﹑果蝇﹑酵母﹑非洲爪蟾等。 2021年,云序生物的客户发表国内首批 eccDNA 研究论文,截至目前为止,云序用户发表的eccDNA文章高达10+篇,其中更有发表于 Nature Communications 等高分期刊上。

云序生物eccDNA相关产品

 

组织细胞环状 DNA 测序

体液样品环状 DNA 测序

体液样品环状 DNA 甲基化测序

WGS(ecDNA测序)

环状 DNA Sanger 测序验证

环状DNA定量PCR

A&A Biotechnology 环状 DNA 纯化柱

 

1.组织细胞环状DNA测序

云序生物基于circle-seq的方法,采用多种手段包括柱纯化去除基因组DNA、酶消化去除线性DNA和线粒体DNA、滚环扩增放大信号,高效地纯化和富集环状DNA,再利用NGS测序和生信分析识别环状DNA。结合优化的实验流程,本环状DNA测序服务具有检出率高﹑准确性好等优点。

技术优势:

使用原装A&A Biotechnology纯化柱高效富集环状DNA

滚环扩增放大环状DNA信号,提高检出率

专业的生信分析:详尽的注释、丰富的图表

图片包含 图表描述已自动生成

云序生物eccDNA测序实验示意图

 

2.体液样品环状DNA测序

针对血清、血浆、尿液、脑脊液等微量的体液样品,云序生物参考卢煜明教授团队开发的方法,酶切去除线性DNA后,利用Tn5转座酶,打开eccDNA环状结构并同时在DNA片段两端加上接头,进行建库及测序。Tn5转座酶法效率高,损耗低,实现血液循环系统中微量的环状DNA的检测。并且本产品能保留环状DNA的原始表达量,使得不同环状DNA间的表达量的比较更为准确。

技术优势:

减少DNA损失

保留原始表达量,不同环状DNA间表达量比较更准确

 

3.体液样品环状DNA甲基化测序
  针对血清、血浆、尿液、脑脊液等微量的体液样品,云序参考卢煜明教授团队 2021 年研发的方法,酶切去除线性DNA后,利用Tn5转座酶,打开环状DNA环状结构并同时在DNA片段两端加上接头,并用酶转化法将未甲基化的C转化为U,进行建库及测序。一次建库测序中同时检测样品中环状DNA及其甲基化位点的信息。

 

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技术优势:

  • 一箭双雕:同时检测环状DNA及其甲基化状况,节约样品,性价比高

  • 单碱基分辨的环状DNA甲基化分析

4.WGS(ecDNA测序)
  云序生物基于WGS方法,对样本进行全基因组测序,并结合Amplicon Architect算法进行ecDNA的识别,以便得到大型ecDNA信息。

5.环状DNA sanger测序

针对测序项目中筛选出的环状DNA,云序提供sanger测序服务验证环状结构。其主要目的在于:为用户提供一种低成本的扩大样品量验证手段,节约实验成本。通过设计反向引物进行PCR扩增,将覆盖环状DNA连接位点的扩增产物进行sanger测序,验证连接位点处序列。

 

6.A&A Biotechnology 环状 DNA 纯化柱

A&A Biotechnology的纯化柱,是绝大部分环状DNA高分文章中所使用的纯化柱。云序生物是该品牌在国内的wei一总代理。

云序生物服务优势

优势一:国内率先提供环状DNA测序服务和环状DNA甲基化测序的公司,同时也是首家有客户发表 10 分以上 eccDNA 论文的公司。

优势二:拥有包括组织细胞/体液样品环状DNA测序服务和环状DNA甲基化测序在内丰富的环状DNA测序产品线。

优势三: A&A Biotechnology 总代理,采用原装A&A Bio纯化柱,环状DNA 纯化效果好。

优势四:一站式服务:您只需按照送样要求向云序生物寄送样品,我们就能为您完成从环状DNA 提取,文库制备,上机测序到数据分析整套服务流程。 

优势五:严格质控流程:云序生物质控流程严格,层层把关,为客户提供高准确度的结果。

优势六:专业化生物信息分析:云序生物强大生物信息团队,满足客户个性化数据分析要求。

 

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