随着糖尿病发病率的逐年攀升和发病年龄的年轻化，胰岛β细胞发育成熟阶段的代谢表观调控成为胰岛领域研究的新热点，m6A RNA修饰对β细胞功能的重要作用已被证实，但其如何调节胰腺发育和内分泌分化尚不清楚。

2023年11月，云序客户上海交通大学医学院附属瑞金医院宁光院士、汪启迪教授团队再次在《Diabetes》以“METTL3-mediated m6A Methylation Controls Pancreatic Bipotent Progenitor Fate and Islet Formation.”为题发表论文，通过m6A MeRIP-seq等测序技术揭示了Mettl3介导的m6A甲基化修饰调控胚胎胰腺双向潜能祖细胞命运和胰岛形成新机制，为糖尿病治疗提供了新的思路。该课题组2020年在《Diabetes》同样发表过“m(6)A mRNA Methylation Controls Functional Maturation in Neonatal Murine β-Cells”文章，以上两篇文章的m6A MeRIP-seq等测序技术均由云序生物提供。
 

 

标题：METTL3-mediated m6A Methylation Controls Pancreatic Bipotent Progenitor Fate and Islet Formation.（Mettl3介导的m6A甲基化修饰调控胚胎胰腺双向潜能祖细胞命运和胰岛形成）

发表时间：2023年11月14日

发表期刊：Diabetes

影响因子：IF=7.7/Q1

研究方法： m6A MeRIP-seq、scRNA
 

研究摘要
 

m6A RNA修饰对β细胞功能的重要作用已被证实，但它如何调控胰腺发育和内分泌分化仍是未知数。在本研究中，作者构建了Pdx1+胰腺祖细胞特异性敲除RNA甲基转移酶Mettl3的转基因小鼠，发现该突变小鼠在2周龄时出现高血糖和低胰岛素血症，胰腺萎缩，胰岛质量减少，导管形成异常增多。在E15.5，Mettl3缺失导致Ngn3+内分泌祖细的显著减少，同时伴随着Sox9 +导管前体细胞的增加。作者发现组蛋白去乙酰化酶1 ( Hdac1 )是双能祖细胞中关键的m6A直接靶点，其变性导致Wnt / Notch信号通路异常激活，内分泌分化受阻。这种转化可以在体外胚胎胰腺培养中通过调控Mettl3-Hdac1-Wnt/Notch信号轴来实现。研究表明，Mettl3通过调节双能祖细胞转换过程中的Hdac1活性来决定内分泌谱系，这可能有助于开发用于糖尿病治疗的靶向内分泌细胞方案。
 

技术路线
 

 

研究结果

（1）Mettl3PKO小鼠早期糖尿病发病及胰岛形成障碍

为了研究Mettl3介导的m6A mRNA甲基化是否参与胰腺发育，将Mettl3flox / flox小鼠与Pdx1 -Cre小鼠杂交，获得胰腺Mettl3基因敲除小鼠( Mettl3pKO ) (图1A)。免疫染色结果显示，Mettl3蛋白在E11.5 Mettl3pKO 胰腺芽的Pdx1+胰腺上皮细胞中选择性缺失(图1B)。作者发现大部分( ~ 81% ) E11.5 Mettl3pKO Pdx1+胰腺细胞中Mettl3表达缺失(图1C)，这表明在胰腺早期器官形成过程中，重组是非常有效的。此外，从E15.5 Mettl3pKO 胚胎胰腺中提取的总RNA的m6A水平降低( p = 0.051 ) （比色法检测m6A整体甲基化水平）(图1D)，表明Mettl3的缺失降低了E15.5 Mettl3pKO 的m6A RNA甲基化水平。

Mettl3PKO小鼠出生时符合预期的me孟德尔比例，在出生后8周内体重与年龄匹配的WT ( Mettl3flox / flox )和杂合子( Pdx1-cre；Mettl3flox/w ,命名为Mettl3pHET)相比没有差异(图1E )。在出生时，Mettl3pKO 小鼠的随机血糖水平与WT对照和杂合子相当(图1F )；然而，突变体在2周龄时随机血糖水平开始显著升高，并且具有严重的高血糖( ~ 30mmol / L ) (图1F )。此外，2周龄Mettl3pKO 小鼠血浆胰岛素水平降低了65.1 % ( p < 0.05 ) (图1G )，表明这些糖尿病突变体，β细胞衰竭占主导地位。
 

 

出生时，Mettl3pKO 小鼠的胰腺重量和大小都显著降低(图1H , 1I)，而WT和Mettl3p KO小鼠在E13.5和E15.5的胰腺重量没有变化 (图1J , 1K)。在P0时，作者观察到amylase+细胞面积减少了52 %(图2A , 2B)。此外，腺泡面积的减少主要归因于腺泡细胞增殖的缺陷：在突变体胰腺中观察到Ki67 + Amylase +细胞的比例减少了近一半。突变体和野生型胰腺组织中Caspase3阳性胰腺细胞的凋亡率无明显变化。组织学分析还显示新生Mettl3pKO胰腺的胰岛质量减少了近50% ( p < 0.001 ) (图2C )，包括胰岛大小(图2D )和切片数量的减少(图2E )。这些结果表明，新生儿胰岛的形成需要Mettl3介导的m6A甲基化
 

 

（2）mettl3的缺失改变了胰腺内分泌细胞的谱系决定

作者对P0胰腺进行了内分泌激素(胰岛素-β、胰高血糖素-α、生长抑素-δ和胰多肽- PP)的免疫染色，结果发现突变胰腺β细胞数百分比显著降低(图2F、2G)。与此同时，α细胞、δ细胞以及PP细胞也减少了(图2G ,附图2B)。相反，Mettl3pKO胰腺中细胞角蛋白19 (CK19)阳性导管细胞显著增加( p < 0.001 )，并伴有轻度扩张的(图2H , 2I)，但未检测到明显的囊肿形成。以上数据表明，Mettl3介导的m6A甲基化影响了胰腺发育过程中胰腺的组成。

为了确定Mettl3的缺失在哪个时间点影响胰腺细胞系，作者检测了E13.5和E15.5时Mettl3pKO和WT胰腺中Ngn3+和Sox9+染色的胰腺上皮细胞的数量(图3A )。在E13.5阶段，我们没有发现Ngn3+和Sox9+细胞数量的变化 (图3B , 3C)。相反，在E15.5期，突变体胚胎胰腺上皮中Ngn3+细胞数量显著减少(图3D )，Sox9+细胞数量显著增加(图3E )。作者还发现在E15.5 Mettl3pKO胰腺中内分泌特异性转录因子Ngn3，Nkx2.2和Nkx6.1的表达降低，而Ngn3的负调控因子Hes1的mRNA表达增加(图3F )。与此同时，E15.5 Mettl3pKO胰腺切片中Nkx2.2或Nkx6.1阳性细胞的数量与同卵胰腺相比显著减少(图3F ,附图3C , 3D)。相反，局限于后期导管细胞的HnfIβ的mRNA表达在E15.5 Mettl3pKO的胰腺中异常增加常增加(图3F)。然而，Ptfla的mRNA表达和控制前胰腺细胞标志物cpa1染色的细胞比率却在E15.5  Mettl3pKO胰腺中异常增加(图3F)。

胰腺尖腺细胞的分化保持不变(图3F,补充图3C、3D)。这些结果表明，Mett13的缺失并不影响E15.5期胰腺尖突细胞的分化。在E15.5期Pal+细胞中缺失Mett13会延缓内分泌祖细胞系的形成，但会触发Sox9+祖细胞的分化。
 

 

（3）对E15.5 Mettl3PKO胰腺细胞进行单细胞RNA测序

为了研究Mett13缺失后胰腺细胞命运决定的分子机制，我们对WT和Mettl3pKO小鼠的E15.5胚胎胰腺细胞进行了单细胞RNA测序scRNA (图4A)，对11049个WT细胞和10928个Mettl3pKO细胞进行了测序，发现了16种转录独特的亚型(图4B)。我们根据已知标记物的表达,即β细胞中Ins1、α细胞中Gcg、内分泌祖细胞中Neurog3、干细胞（也称为双能祖细胞）中Spp1或尖突细胞中Cpa1的表达（图4C），以及间质、间皮细胞、内皮细胞、免疫细胞、血管细胞和神经元细胞的表达，确定了预期的群体（图4C)。发现内分泌系细胞，包括内分泌祖细胞和内分泌细胞减少（图4D）。

然后，作者对数据集中的内分泌细胞谱系进行了亚聚类(图4E )，根据胚胎胰腺假性时间分析确定了11个有效的簇，包括β细胞簇，δ细胞簇，2个α细胞簇，3个内分泌祖细胞簇，4个双能细胞簇和3个未定义的小团簇(图4E , 4F和附图4A)。根据Ngn3、Chgb 和Fev的表达，内分泌祖细胞（EP)可进一步分为3个亚群（EP_early、EP_mid 和EP_late) (图4F，附图4A)。定量分析显示，突变体中的EP、β、α和δ细胞均显著减少(图4G)。根据不同的细胞命运分离和调控特征，鉴定出四个双能祖细胞(BP)群,其中BP_early 1、 BP_early 2和BP_mid细胞代表较早的发育阶段，而BP_late细胞被认为是发育轨迹上的内分泌祖细胞的前体(附图4A，4B)。值得注意的是，检测到BP_late细胞的不适当积累(523 vs 388, Mettl3pKO vs  WT) (图4G) 。上述数据表明，Mett13的缺失阻碍了双能祖细胞在E15.5晚期向内分泌祖细胞的转变。

作者比较了WT小鼠和Mettl3pKO小鼠BP_late细胞的基因表达（图4H 和 4I)。对BP_late亚群的GO分析显示，Mettl3pKO中高表达的基因与上皮细胞迁移的正调控、胚胎上皮管形成和细胞迁移的正调控有关，而下调的基因则富集在与氧化磷酸化、ATP代谢过程、糖代谢和内分泌胰腺发育相关的GO条目中(图4H )。

有趣的是，Wnt信号通路(被称为内分泌分化抑制剂），而在下调的条目中发现了Wnt信号通路的负调控作用(图4H )。Mettl3基因的缺失导致BP _ late簇中与内分泌分化相关的重要基因表达量降低，即Nkx6.1，Hdac1，Nr5a2和Kcnq1(图4I )。相反，参与早期上皮细胞分化和上皮管形成的基因( Onecut2，Nr2f2，Sox4，Sox11，Wnt4，Hnf1β等)显著上调(图4I )。值得注意的是，SOX4对于正常的内分泌胰腺发育也至关重要。
 

 

（4）在E15.5 Mettl3PKO胰腺中确定Hdac1为m6A靶基因

为了鉴定改变的转录本是否存在m6A修饰，作者进一步对E15.5 WT和Mettl3pKO胰腺细胞进行了m6A MeRIP-seq。在WT和Mettl3pKO中分别发现了1288个共有峰以及9228个和2653个特异峰(图5A)。其中与WT相比，Mettl3pKO发现了1241个高甲基化和6543个低甲基化m6A峰(图5A)。m6A MeRIP-seq数据表明，绝大多数m6A峰分布在转录本的CDS和3’UTR(图5B)，而Mettl3pKO的m6A峰密度主要在CDS区域降低（图5C)。WT组和Mettl3pKO组代表性motif分析为GGACU和DGGACU[D=A/G/U] (图5D)。甲基化基因转录本的差异表达分析表明，相比WT组，Mettl3缺失的胰腺细胞有1029个基因甲基化水平较高，有3985个水平较低（图5E)。Pathway分析表明，在Mettl3缺失的胰腺细胞中，低甲基化转录本明显富集在与年轻成熟型糖尿病(MODY)、胰岛素信号通路、胰腺分泌相关的转录本中(图5F)。

为了确定Mettl3介导的控制内分泌细胞系的m6A直接靶基因，作者比较了在WT和Mettl3pKO在Bp_late细胞中通过scRNA和m6A MeRIP-seq发现的优先变化的转录本，相关分析最终确定了m6A修饰水平下降，转录本水平也下调的转录本70个以及43个上调转录本的(图5G)。值得注意的是，内分泌转录因子Nkx6.1和Kcnq1被下调，而参与胰腺导管形成的Hnf1B在Mettl3缺失后出现了不同程度的上调(图5G)。在m6A介导的下调转录本中，我们注意到作为Wnt和Notch通路(37）上游抑制因子的Hdac1表达发生了变化(图5H)。有趣的是，Hdac1 mRNA在双能祖细胞中明显下调，但在内分泌祖细胞中的表达水平相当(附图5A、5B)。IGV可视化结果显示，Hdac1转录本在WT的mRNA中m6A修饰丰富，但在敲除Mettl3后m6A峰减少(图5H)。作者通过MeRIP-qPCR进一步证实，在E15.5 Mettl3pKO胰腺细胞中，Hdac1 mRNA上的m6A减少。此外，通过对P0胰腺进行RIP-qPCR检测，发现Mettl3蛋白能与Hdac1 mRNA相互作用(图5J)。

众所周知，mRNA转录本上的m6A修饰可能会影响mRNA的稳定性和翻译。作者随后解剖了E13.5完整胚胎胰腺芽，并用ShMettl3慢病毒或对照病毒处理48小时，以评估Mettl3对Hdac1表达的直接影响。作者发现在胚胎胰腺中敲除Mett13 48小时后，Hdac1的蛋白丰度显著下降(图5K)。在加入转录抑制剂ActD后，Sh Mettl3处理E13.5胰芽加速了Hdac1 mRNA的衰减，表明Mettl3的缺失直接降低了Hdac1 mRNA的稳定性(图5L)。然后对E15.5WT和Mettl3pKO胚胎胰腺进行了Hdac1免疫荧光原位染色，发现Mettl3pKO小鼠Sox9+双能祖细胞的Hdac1荧光强度明显降低(图5M)。同时Mettl3pKO小鼠胚胎胰腺细胞中，Wnt信号通路的核心蛋白β-catenin和Notch信号通路的效应因子Hes1的表达同时上调(图5N)。
 

 

（5）Mettl3/Hdac1通路控制内分泌谱系决定

为了解Hdac1是否介导了双能主干内分泌祖细胞的分化，作者首先使用Hdac1抑制剂小白菊内酯或DMSO处理E13.5 WT胚胎胰腺2天。小白菊内酯不仅抑制了Hdac1的表达，还诱导了Wnt/β-catenin信号通路和Notch/Hes1信号的激活(图6A)。与此同时，用小白菊内酯抑制Hdac1活性48小时后，胚胎胰芽中Ngn3阳性细胞的数量明显减少，但Sox9阳性细胞的数量却增加了(图6B和6C)。

然后，作者探讨了在Mettl3pKO胚胎胰腺中恢复Hdac1的表达是否能挽救向内分泌细胞分化的障碍。作者解剖了E13.5 WT和Mettl3pKO胚胎胰腺芽，并在培养基中加入Hdac1激动剂ITSA-1或DMSO。培养2天后，作者发现ITSA-1处理可显著增加WT胰腺芽中Hdac1的表达(图6D）,而不会改变Wnt/β-catenin和Notch/Hes1信号转导（图6D）。ITSA-1处理也不影响WT胰腺芽中Ngn3+/m+细胞或So9+细胞的数量(图6E-G)。重要的是，ITSA-1处理阻止了Wnt/β-catenin和Notch/Hes1信号的异常诱导(图6D)，并挽救了Mettl3pKO胰腺芽中Ngn3+内分泌细胞和Ins+β细胞的减少以及Sox9+细胞的增加(图6E-G)。以上数据有力地表明，Mettl3/Hdac1通路是胰腺发育过程中内分泌谱系决定所必需的。
 

 

全文小结

本研究发现胰腺祖细胞中METTL3的缺失会减少内分泌祖细胞池的大小以及出生后胰岛的质量，并导致小鼠早发糖尿病。

METTL3缺失干扰了胰腺发育过程中双能祖细胞向内分泌系或导管系分化的命运决定。

METTL3-HDAC1-WNT/NOTCH轴在体内和体外对内分泌细胞的形成至关重要。
 

云序生物m6A修饰研究五大模块

01 m6A RNA修饰测序

m6A RNA修饰测序（m6A-MeRIP-seq）

对m6A RNA甲基化，目前流行的检测手段为m6A-MeRIP-Seq技术，适用于m6A RNA甲基化谱研究，快速筛选m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多种非编码RNA的m6A测序：

m6A 全转录组测序（涵盖mRNA，LncRNA，circRNA）

m6A  LncRNA测序（涵盖LncRNA和mRNA）

m6A  Pri-miRNA测序（涵盖Pri-miRNA和mRNA）

m6A  mRNA测序

m6A  miRNA测序

02检测整体m6A修饰水平

比色法检测整体RNA修饰水平

快速检测m6A整体甲基化水平

03 m6A RNA修饰上游酶的筛选

m6A RNA修饰相关酶PCR芯片

寻找上游直接调控m6A RNA甲基化的甲基转移酶。

04 m6A RNA修饰靶基因验证

MeRIP-qPCR/GenSeq® MeRIP试剂盒

云序提供各类不同修饰的MeRIP-qPCR服务以及销售GenSeq® MeRIP试剂盒，可针对mRNA，lncRNA，环状RNA等不同类型的RNA分子进行检测，低通量验证RNA修饰靶基因表达水平。

05 机制互作研究

5.1 RIP-seq/qPCR/GenSeq® RIP试剂盒

筛选或验证RNA修饰直接靶点，研究RNA修饰靶基因的调控机制。

5.2 RNA pull down -MS/WB

筛选或验证目标RNA互作基因或蛋白，研究相应的分子调控机制。

5.3 ChIP-seq

筛选或验证目标蛋白与DNA互作，研究相应的分子调控机制。

5.4 Ribo-seq

筛选翻译水平发生变化的RNA分子，研究相应的分子调控机制。

5.5 SLAM-seq

筛选稳定性发生变化的RNA分子，研究相应的分子调控机制。

5.6 CHIRP-seq

筛选或验证目标RNA与DNA互作，研究相应的分子机制。
 

云序生物服务优势

优势一：云序累计支持客户发表100 +篇RNA修饰SCI论文，合计影响因子1000 +

优势二：累计完成数千例 RNA甲基化测序样本，全面覆盖医口、农口等各类样本。

优势三：全面检测mRNA和各类非编码RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。

优势四：提供m6A一站式服务：m6A整体水平检测、m6A测序、MeRIP-qPCR验证、RIP和RNA pull-down、Ribo-seq、SLAM-seq、CHIRP-seq、CHIP-seq等。

优势五：率先研发超微量MeRIP测序技术，RNA量低至500ng起。

优势六：国内较全的RNA修饰测序平台，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙酰化和2'-O-甲基化、假尿嘧啶RNA测序。

 

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