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客户文章|IF=10.6—甲状腺癌中m5C甲基转移酶NSUN2通过维持tRNA的稳定性促进密码子依赖性的致癌翻译

发布时间:2023-12-28 13:33 |  点击次数:

近日,中南大学湘雅医院甲状腺外科李新营教授团队在国际著名期刊《Clinical and Translational Medicine》(JCR Q1, IF=10.6)在线发表了题为“The m5C methyltransferase NSUN2 promotes codon-dependent oncogenic translation by stabilising tRNA in anaplastic thyroid cancer”(m5C甲基转移酶NSUN2通过维持tRNA的稳定性促进密码子依赖性的致癌翻译影响甲状腺未分化癌的进展)的原创性研究。云序生物有幸参与了该文章的m5C BS-seq、tRNA-seq、Ribo-seq等多项测序工作。

标题:“The m5 C methyltransferase NSUN2 promotes codon-dependent oncogenic translation by stabilising tRNA in anaplastic thyroid cancer”(m5C甲基转移酶NSUN2通过维持tRNA的稳定性促进密码子依赖性的致癌翻译影响甲状腺未分化癌的进展)

发表时间:2023年12月15日

发表期刊:Clinical and Translational Medicine

影响因子:IF=10.6/Q1

研究方法:RNA-seq、LC-MS、tRNA-seq、m5C BS-seq、Ribo-seq

文章链接: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ctm2.1466
 

文章摘要

甲状腺未分化癌(ATC)是一种特殊甲状腺癌病理类型,极具侵袭性且目前尚无有效的治疗方式,致死率接近 100%。该研究证实NSUN2通过调节m5C修饰来维持tRNA的稳定性,促进ATC中的促癌翻译重编程。NSUN2在ATC中高表达并与肿瘤失分化相关,敲低NSUN2可抑制ATC细胞增殖和侵袭,NSUN2通过介导tRNA Leu-CAA和tRNA Leu-CAG 的m5C修饰,稳定相应tRNA的二级结构,进而加快c-Myc、BCL2、RAB31、JUNB和TRAF2促癌翻译效率,此外,NSUN2介导的m5C修饰水平在不同tRNA同位解码器中的差异在一定程度上导致了密码子依赖性翻译偏倚。该研究结果不仅揭示了m5C甲基转移酶NSUN2的促肿瘤活性,同时揭示了tRNA稳定性的动态控制及其下游癌基因的表达,由此引发了下游密码子依赖性致癌翻译网络反应,从而促进了ATC细胞增殖和侵袭,为靶向肿瘤细胞的翻译重编程、恶性转化和耐药提供了新的理论。
 

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技术路线
 

文章研究思路
 

研究结果
 

(1)NSUN2在ATC中上调,且促进ATC癌症进展

对四组甲状腺癌的RNA-seq数据进行分析发现,与甲状腺乳头状癌(PTC)、低分化甲状腺癌(PDTC)或正常甲状腺组织相比,ATC中NSUN2的mRNA显著升高。与NSUN2low组相比,NSUN2high组中有几个富集的通路,包括蛋白质水解、RNA代谢、细胞对DNA损伤刺激的反应、细胞周期和Rho GTPases的信号传导。通过数据库检索发现,甲状腺癌患者NSUN2基因的突变谱显示遗传改变<0.2%,且NSUN2的高表达与PTC患者的总生存率显著降低相关。提示NSUN2在关键细胞过程中的潜在调节作用及其与甲状腺癌侵袭性的关联。作者通过对NSUN2在甲状腺癌患者中的表达进行验证分析。发现NSUN2在ATC中显著上调,也与细胞低分化状态有关。

通过敲低及过表达NSUN2发现,NSUN2的敲低显著抑制ATC细胞的增殖,削弱了细胞的侵袭和迁移能力,导致细胞周期阻滞。然而,NSUN2过表达使细胞增殖、集落形成、侵袭和迁移能力增强,促进了细胞周期的进展。综上所述,说明NSUN2在体外ATC进展中的各种基本功能。
 


 

(2)ATC中NSUN2的抑制降低了细胞对化疗药物的耐受性

为了验证NSUN2在ATC对化疗药物的耐受性中也起重要作用,作者测定了盐酸阿霉素和顺铂在NSUN2敲低或过表达的癌细胞中的半最大抑制浓度(IC50)。结果发现,在NSUN2敲低细胞中,盐酸阿霉素和顺铂的IC50值显著降低,而在NSUN2过表达细胞中,盐酸阿霉素和顺铂的IC50值升高。时间依赖性图显示,NSUN2敲低缩短了平台期,提高了化疗药物的疗效。在低剂量治疗下,NSUN2敲低降低了ATC细胞对顺铂或盐酸阿霉素的耐受性。而当暴露于两种化疗药物时,NSUN2过表达细胞的存活率显著增加。以上结果表明,NSUN2可以促进细胞获得耐药性。因此,常规化疗药物联合RNA胞嘧啶-5甲基化抑制剂可能提供有效的抗癌策略。
 

图3
 

(3)靶向NSUN2表达抑制ATC进展和体内耐药

为了阐明NSUN2在体内ATC进展中的作用,作者建立了体外移植小鼠模型。结果发现注射shN细胞的小鼠的肿瘤生长速度明显慢于注射载体的小鼠,且降低了体内ATC的增殖。在肺转移小鼠模型中,心内注射NSUN2敲低和对照kkm -5 M,显示shN ATC细胞发生较少的转移结节,NSUN2敲低还减轻了ATC细胞对肺泡组织的破坏。在盐酸阿霉素或顺铂治疗下,shN组肿瘤体积和重量明显低于对照组。NSUN2敲低显著提高了药物疗效。但值得注意的是,药物治疗后,shN组的P53染色有所减轻。这种现象可能与凋亡诱导的细胞减少有关。因此,NSUN2的敲低降低了ATC细胞的增殖和转移,而在两种药物的治疗下,ATC细胞的体内存活率进一步降低。
 

图4
 

(4)NSUN2调控tRNA m5C的修饰,促进ATC的全局翻译

用LC-MS检测细胞m5C整体修饰水平,结果显示,在shN细胞中tRNA的m5C修饰水平整体减少。通过m5C BS-seq发现,NSUN2敲低后,大多数tRNA的m5C水平大幅降低,已知的NSUN2底物中的几个位点m5C修饰消失。此外,还发现甲基化水平的变化最有可能出现在可变环和TΨC臂上,表明它们对NSUN2敲低处理很敏感。通过嘌呤霉素摄入实验,发现NSUN2敲低导致细胞系整体蛋白合成减少,且可通过过表达轻度挽救。这些结果进一步支持了tRNA m5C促进蛋白合成的作用,暗示NSUN2可能通过tRNA表观遗传修饰来调控翻译进程。
 

图5
 

(5)NSUN2调节促进ATC进展的促癌mRNA的翻译,且部分TE下调的肿瘤相关基因表现出密码子使用偏倚

通过对对照组和shN细胞组的mRNA-seq和Ribo-seq发现,对照组与shN细胞组之间的差异表达转录本富集于内质网蛋白加工相关通路、肿瘤、细胞周期和TNF信号通路中的microRNA。NSUN2敲低显著改变了ATC细胞中的基因翻译水平,减少翻译的基因与内质网蛋白质加工、自噬和内吞作用相关。通过对翻译效率(TE)的分析发现,NSUN2敲低后,mRNA亚群的TE发生变化。其中,前1000个基因富集于几种癌症相关途径,包括RNA代谢、翻译、细胞应激反应调控和VEGFA-VEGFR信号通路,表明NSUN2在一个关键的促癌程序中发挥作用。与ATC进展相关的候选基因的验证发现,表明NSUN2促进了翻译。有趣的是,NSUN2抑制降低了BCL2蛋白水平。NSUN2敲低降低了c-Myc的mRNA和TE水平。然而,mRNA水平的降低并不能解释c-Myc的TE急剧下降。在ATC组织样本中,与NSUN2低表达的组织样本相比,尽管mRNA水平较低,但较高的NSUN2表达可以维持较高的蛋白表达。结果表明,致癌的NSUN2调节对ATC抗凋亡和发育至关重要的mRNA亚群的翻译。
 


 

作者又对TE显著变化的基因的CDS序列密码子使用特征进行了分析,发现密码子使用偏向主要受进化过程中自然选择的影响,TE上调基因和TE下调基因的RSCU值无明显差异。作者还通过双荧光素酶报告基因检测发现NSUN2催化tRNA Leu-CAA的m5C修饰,并增强了UUG-rich mRNA的翻译。tRNA Leu-CAA和Leu-CAG之间m5C甲基化的差异可以解释35.7% UUG密码子偏倚导致TE下调。
 

图8
 

(6)敲除NSUN2基因逆转了有害的c-Myc对NSUN2周期的影响

c-Myc是NSUN2的上游转录因子。研究表明,c-Myc有一个亮氨酸拉链二聚化结构域,这是有效的DNA结合所必需的,在这个结构域中,c-Myc基因上的大多数亮氨酸残基由TTG编码。该结构域的单个氨基酸替换会使N-myc基因产物的转化能力失活,亮氨酸拉链结构的突变也会导致c-Myc的功能失活。c-Myc功能需要在其锌指结构中正确翻译TTG编码的亮氨酸,这表明NSUN2敲低导致tRNA Leu-CAA中NSUN2介导的m5C早期减少,从而导致上游转录因子c-Myc中富含TTG的亮氨酸的翻译受损。
 

图9
 

(7)NSUN2介导的m5C修饰对tRNA的稳定性起作用

作者通过实验发现,在NSUN2过表达的细胞中观察到tRNA的稳定性增加。通过比较成熟tRNA Leu-CAA的完整序列和相关的裂解片段,并设计引物量化细胞中的tRNA产物发现,NSUN2的敲低降低了tRNA的Leu-CAA储备,增加了3 ' -tRF片段。然而,在8305C细胞中,NSUN2过表达阻止了tRNA的切割。对这些可能的片段在tRNA Leu-CAA上的切割位点进行了评估发现,m5C的缺失可能导致裂解酶对tRNA位点的可及性增加,类似于血管生成素切割反密码子环的机制。tRNA-seq进一步证实了m5C修饰与tRNA表达水平之间的相关性。NSUN2敲低后,少量甲基化的tRNA Leu-CAA 4-1表达仍然升高,而其他m5C缺失的tRNA Leu-CAA表达则下降。此外,tRNA表达与m5C水平呈正相关,这些数据支持tRNA m5C修饰与tRNA稳定性之间的联系。
 

图10
 

全文总结

  • NSUN2基因在ATC中表达量上调,且促进了ATC癌症的进展

  • 在ATC中,敲除NSUN2降低了细胞对化疗药物盐酸阿霉素和顺铂的耐受性,常规化疗药物联合RNA胞嘧啶-5甲基化抑制剂可能提供有效的抗癌策略

  • 敲除NSUN2降低了ATC细胞的增殖和转移,而在两种药物的治疗下,ATC细胞的体内存活率进一步降低

  • NSUN2可调控tRNA的m5C修饰来调控翻译进程,可通过过表达轻度挽救

  • NSUN2调节促进ATC进展的促癌mRNA的翻译,且部分TE下调的肿瘤相关基因表现出密码子使用偏倚

  • NSUN2敲低导致tRNA Leu-CAA中NSUN2介导的m5C早期减少,从而导致上游转录因子c-Myc中富含TTG的亮氨酸的翻译受损

  • NSUN2介导的m5C修饰对tRNA的稳定性起作用

该研究结果不仅揭示了m5C甲基转移酶NSUN2的促肿瘤活性,同时揭示了tRNA稳定性的动态控制及其下游癌基因的表达,由此引发了下游密码子依赖性致癌翻译网络反应,从而促进了ATC细胞增殖和侵袭,为靶向肿瘤细胞的翻译重编程、恶性转化和耐药提供了新的理论。

云序生物m5C修饰研究五大模块

01 m5C RNA修饰测序

对m5C RNA甲基化,云序可提供mRNA和多种非编码RNA测序:

m5C-MeRIP-seq

m5C-BS-seq

02检测整体m5C RNA修饰水平

LC-MS/MS检测整体RNA修饰水平

精准高效,可以实现一次检测,9类修饰水平检测,一步到位。

比色法检测整体RNA修饰水平

快速检测m5C整体甲基化水平

03 m5C RNA修饰上游酶的筛选

m5C RNA修饰相关酶PCR芯片

寻找上游直接调控m5C RNA甲基化的甲基转移酶。

04 m5C RNA修饰靶基因验证

MeRIP-qPCR/GenSeq® MeRIP试剂盒

云序提供各类不同修饰的MeRIP-qPCR服务以及销售GenSeq® MeRIP试剂盒,可针对mRNA,lncRNA,环状RNA等不同类型的RNA分子进行检测,低通量验证RNA修饰靶基因表达水平。

05机制互作研究

5.1 RIP-seq/qPCR/GenSeq® RIP试剂盒

筛选或验证RNA修饰直接靶点,研究RNA修饰靶基因的调控机制。

5.2 RNA pull down -MS/WB

筛选或验证目标RNA互作基因或蛋白,研究相应的分子调控机制。

5.3 ChIP-seq

筛选或验证目标蛋白与DNA互作,研究相应的分子调控机制。

云序生物服务优势

优势一:云序累计支持客户发表100 +篇RNA修饰SCI论文,合计影响因子1000 +

优势二:累计完成数千例 RNA甲基化测序样本,全面覆盖医口、农口等各类样本。

优势三:全面检测mRNA和各类非编码RNA(circRNA,lncRNA,Pri-miRNA等)。

优势四:提供m6A一站式服务:m5C整体水平检测、m5C测序、MeRIP-qPCR验证、RIP和RNA pull-down等。

优势五:率先研发超微量MeRIP测序技术,RNA量低至500ng起。

优势六:国内较全的RNA修饰测序平台,提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙酰化和2'-O-甲基化、假尿嘧啶等修饰的测序技术。
 

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