eccDNA近年来一直是科研的热点，目前已有众多研究发现eccDNA在衰老、肿瘤、耐药、凋亡等方面的强大调控功能，eccDNA的产生机制、作用机理正在不断的被探索！ eccDNA测序技术也逐渐成熟，新的测序方法、数据库等不断涌现。而一般在研究过程中，我们进行了高通量测序以后，还需要进行一些对应的低通量验证实验才能更好地验证实验数据的真实性！

那eccDNA验证实验有哪些？每一步又该怎么设计？验证结果又该怎么看呢？

云序生物为助力您完成eccDNA的后续验证，设计了详细的“eccDNA后续验证方案”供参考，接下来就跟着我们一起来看看具体的验证方案吧！

 

第一步：验证 eccDNA的表达量（qPCR）

样品：进行 qPCR 实验时样品量最少需要三个重复，即3 VS 3。

（1）选取 eccDNA

根据 eccDNA 测序报告中的差异表达谱，选取 10~20个与研究方向相关且差异表达的 eccDNA（即一组表达量比较高，另一组表达量为 0或者比较低这种差异很大的eccDNA）。

（2）qPCR 验证

通过 eccDNA qPCR 实验，在各组测序样品（或与测序样品同样处理的样品）中验证这些 eccDNA 的真实表达水平。

（3）eccDNA初筛

根据qPCR 结果，挑选出处理组与对照组间表达量存在显著差异的 eccDNA。

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*注：eccDNA 测序识别方式是通过识别环上wei一的 junction 位点，且测序过程中是随机片段化，所以测序结果中处理组eccDNA比较高，对照组 eccDNA 表达量为 0，并不表示样本中该 eccDNA 的真实表达量一定为 0！因此需要进行定量 PCR 的验证，验证eccDNA的真实表达水平！！！

 

#结果示例#

根据eccDNA碱基序列，设计反向引物（eccDNA引物设计教程）mp.weixin.qq.com/s/xCmFzWZBBcrmyapGv0dNYg，并进行qPCR。

定量PCR溶解曲线及Ct值（例图）

 

第二步：验证环状结构（sanger 测序+电泳鉴定）

样品：选择qPCR结果中信号最强的且组间差异显著的1个eccDNA进行环状结构的验证。

（1）sanger 测序

选取第一步qPCR筛选出来的eccDNA，将覆盖eccDNA连接位点的 PCR 扩增产物进行sanger测序，检测环状连接位点，以验证该eccDNA确实具有环状结构。

（2）中间产物电泳鉴定

可针对基因组DNA、富集后的eccDNA、滚环扩增后的eccDNA和无模板参照（NTA）等类型中间产物，进行目标eccDNA的凝胶电泳实验，可进一步证实 eccDNA的存在。

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*注：高通量测序数据量较大，分析识别过程可能会存在一定噪声和误差，或者存在一些非特异性信号。因此，需要通过sanger测序和电泳鉴定证实筛选出的eccDNA结果的准确性！

 

#结果示例#

根据eccDNA碱基序列，设计反向引物（eccDNA引物设计教程）https://mp.weixin.qq.com/s/xCmFzWZBBcrmyapGv0dNYg，并进行PCR扩增，接着将覆盖eccDNA连接位点的PCR扩增产物进行sanger测序。eccDNA长度跨度200bp-20kb，验证率超过80%！

Circle-Seq和Sanger测序结果比较（例图）

[来自TIAM1和PKNOX1基因的eccDNA连接位点前后15bp PCR产物测序结果。

黑色（上）：表示基于Circle-Seq得到的eccDNA连接序列；

蓝色（下）：表示基于Sanger测序结果的eccDNA准确环状位点；

阴影（红色）序列：表示连接位点]

 

采用outward和inward两种方式进行引物设计（eccDNA引物设计教程）https://mp.weixin.qq.com/s/xCmFzWZBBcrmyapGv0dNYg，并进行相应的outward PCR和inward PCR，然后将PCR产物跑胶，观察胶图结果。

中间产物电泳引物设计原理图（例图）

 

inward扩增引物不包含junction位点，在基因组DNA和eccDNA中均能扩增出产物；而outward扩增引物包含junction位点，在基因组中扩增出的产物不wei一，所以胶图条带是弥散的，而在富集后的eccDNA中能扩增出大量的eccDNA，所以条带较清晰明亮。

中间产物电泳鉴定结果图

 

第三步：扩大样品量验证 eccDNA biomaker（qPCR）

如果您是想要研究eccDNA生物标志物，还需要进行“第三步扩大样品量后的eccDNA验证”，详情如下：

样品：研究biomaker对样品量有一定要求，最少需要30以上的样品量，即处理组 VS 对照（30 vs 30）。

eccDNA biomaker 验证：

选取qPCR中表达差异且已验证出环状结构的 eccDNA，进行 eccDNA biomaker 的定量 PCR 验证。通过大批量样品验证，发现 eccDNA 在处理组中呈现出差异表达，就可以证实其具有可以作为biomaker的潜力。

*注：处理组和对照组间差异表达的 eccDNA，并不一定是实验处理导致的，可能是小批量小鼠个体间差异引起的，也可能是由于实验处理导致一些细胞死亡，存活下来的细胞中 eccDNA 丰度增加，但实际 eccDNA 的表达并未受实验处理而发生增加或减少。因此通过大批量的验证，可以消除个体差异或其他因素产生的噪音。

云序生物可提供以上eccDNA qPCR、sanger测序、中间产物电泳鉴定等后续验证实验！

 

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云序生物eccDNA测序

云序生物是国内率先提供环状DNA测序服务的公司，早在2018年已启动了环状DNA测序技术的开发。2019年，云序发布了组织细胞环状 DNA 测序（circle-seq），并成为A&A Bio du家代理（该品牌的环状 DNA 纯化柱被绝大部分环状DNA高分文章采用）。2020年，云序又相继发布了体液样品环状DNA测序及体液样品环状DNA甲基化测序服务，拥有丰富的环状DNA测序产品线。云序生物环状DNA测序采用双端测序，上机测序数据量24G。迄今为止，我们已经完成上千例样品的环状DNA测序，积累了丰富的项目经验，样品类型涵盖：组织﹑细胞﹑血清﹑血浆﹑尿液等，物种涵盖：人﹑小鼠﹑大鼠﹑拟南芥﹑果蝇﹑酵母﹑非洲爪蟾等。 2021年，云序生物的客户发表国内首批 eccDNA 研究论文，其中更有发表于 Nature Communications 上的高分研究。

 

云序生物eccDNA相关产品

组织细胞环状 DNA 测序

体液样品环状 DNA 测序

体液样品环状 DNA 甲基化测序

环状 DNA Sanger 测序验证

环状DNA定量PCR

A&A Biotechnology 环状 DNA 纯化柱

1.组织细胞环状DNA测序

云序生物基于circle-seq的方法，采用多种手段包括柱纯化去除基因组DNA、酶消化去除线性DNA和线粒体DNA、滚环扩增放大信号，高效地纯化和富集环状DNA，再利用NGS测序和生信分析识别环状DNA。结合优化的实验流程，本环状DNA测序服务具有检出率高﹑准确性好等优点。

技术优势：

使用原装A&A Biotechnology纯化柱高效富集环状DNA

滚环扩增放大环状DNA信号，提高检出率

专业的生信分析：详尽的注释、丰富的图表

云序生物组织细胞样品eccDNA测序实验示意图

2.体液样品环状DNA测序

针对血清、血浆、尿液、脑脊液等微量的体液样品，云序生物参考卢煜明教授团队开发的方法，酶切去除线性DNA后，利用Tn5转座酶，打开eccDNA环状结构并同时在DNA片段两端加上接头，进行建库及测序。Tn5转座酶法效率高，损耗低，实现血液循环系统中微量的环状DNA的检测。并且本产品能保留环状DNA的原始表达量，使得不同环状DNA间的表达量的比较更为准确。

技术优势：

减少DNA损失

保留原始表达量，不同环状DNA间表达量比较更准确

3.体液样品环状DNA甲基化测序
针对血清、血浆、尿液、脑脊液等微量的体液样品，云序参考卢煜明教授团队 2021 年研发的方法，酶切去除线性DNA后，利用Tn5转座酶，打开环状DNA环状结构并同时在DNA片段两端加上接头，并用酶转化法将未甲基化的C转化为U，进行建库及测序。一次建库测序中同时检测样品中环状DNA及其甲基化位点的信息。

 

云序生物体液样品eccDNA测序实验示意图

技术优势：

一箭双雕：同时检测环状DNA及其甲基化状况，节约样品，性价比高

单碱基分辨的环状DNA甲基化分析

 

4.环状DNA sanger测序

针对测序项目中筛选出的环状DNA，云序提供sanger测序服务验证环状结构。其主要目的在于：为用户提供一种低成本的扩大样品量验证手段，节约实验成本。通过设计反向引物进行PCR扩增，将覆盖环状DNA连接位点的扩增产物进行sanger测序，验证连接位点处序列。

5.A&A Biotechnology 环状 DNA 纯化柱

A&A Biotechnology的纯化柱，是绝大部分环状DNA高分文章中所使用的纯化柱。云序生物是该品牌在国内的wei一总代理。

 

云序生物服务优势

优势一：国内率先提供环状DNA测序服务和环状DNA甲基化测序的公司，同时也是较早有客户发表 10 分以上 eccDNA 论文的公司。

优势二：拥有包括组织细胞/体液样品环状DNA测序服务和环状DNA甲基化测序在内丰富的环状DNA测序产品线。

优势三： A&A Biotechnology 总代理，采用原装A&A Bio纯化柱，环状DNA 纯化效果好。

优势四：一站式服务：您只需按照送样要求向云序生物寄送样品，我们就能为您完成从环状DNA 提取，文库制备，上机测序到数据分析整套服务流程。 

优势五：严格质控流程：云序生物质控流程严格，层层把关，为客户提供高准确度的结果。

优势六：专业化生物信息分析：云序生物强大生物信息团队，满足客户个性化数据分析要求。

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