骨骼的尺寸和形状在整个生命过程中被精确建模和重塑，以确保骨骼的结构和完整性。骨髓间充质干细胞( bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs )的成骨分化及其机制是骨形成和骨重建的重要问题。BMSCs的分化缺陷和功能障碍会导致年龄相关的变化和疾病，如肌肉减少症和骨质疏松症，BMSCs也被认为是促进骨再生治疗的相关靶点。

迄今为止，在mRNA、tRNA、rRNA、核小RNA ( snRNA )、核仁小RNA ( snoRNA )和长链非编码RNA ( lncRNA )中已经鉴定出170多种RNA修饰类型。其中，N6-甲基腺苷( m6A )是哺乳动物细胞中最普遍的 mRNA 修饰。它被m6A甲基转移酶、去甲基化酶动态沉积和去除，并被m6A特异性结合蛋白识别。尽管m6A参与了包括BMSC分化在内的多种生物学过程，但其在BMSC成骨分化过程中的确切作用和机制仍需进一步阐明。

2021年11月21日，云序客户上海交通大学医学院附属新华医院张晓玲团队在《Cell Death Disease》以“The m6A “reader” YTHDF1 promotes osteogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells through translational control of ZNF839”为题发表论文，通过m6A MeRIP-seq、RIP-seq（云序生物提供）等测序技术揭示了m6A阅读蛋白YTHDF1通过调控ZNF839翻译，增强骨髓间充质干细胞BMSC成骨机制，为骨质疏松症的防治提供了新的思路。

标题：The m6A “reader” YTHDF1 promotes osteogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells through translational control of ZNF839（ m6A 阅读蛋白YTHDF1调控ZNF839 翻译促进骨髓间充质干细胞成骨）

发表时间：2021年11月21日

发表期刊：Cell Death Disease

影响因子：IF=9.2/Q1

研究方法： m6A MeRIP-seq、RIP-seq

文章链接： https://www.nature.com/articles/s41419-021-04312-4
 

研究摘要

N6 -甲基腺苷( m6A )是人骨髓间充质干细胞( hBMSCs )分化所必需的。然而，其内在机制在很大程度上是未知的。为了明确m6A结合蛋白YTHDF1在hBMSCs体内成骨中的可能作用，我本研究通过构建Ythdf1 KO小鼠，发现敲除Ythdf1会导致体内骨量下降。在小鼠BMSCs中敲除Ythdf1和在hBMSCs中敲低YTHDF1均抑制了细胞的体外成骨分化。通过m6A MeRIP-seq、RIP-seq，作者发现ZNF839 (一种锌指蛋白)是YTHDF1的一个靶基因。研究还验证了其在小鼠中的同源蛋白Zfp839受Ythdf1的m6A依赖的翻译调控。Zfp839通过与Runx2相互作用并进一步增强Runx2的转录活性来增强BMSC的成骨能力。这些发现将提高对BMSC成骨调控机制的认识，为骨质疏松症的预防和治疗提供新的思路。
 

技术路线
 

 

研究结果

 

（1）YTHDF1与骨质疏松症有关，在人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）成骨分化过程中表达增加

为了了解m6A在hBMSC成骨和骨质疏松症中的可能作用，作者通过RT-PCR检测了三名年轻健康男性个体（年龄范围：24-29岁，平均：26.7岁）和三名老年骨质疏松症男性患者（年龄范围：71-77岁，平均：74.8岁）获得的hBMSCs中m6A调节酶的mRNA水平。与其他m6A调节酶相比，YTHDF1 mRNA的水平随着年龄的增长而显著降低（图1A）。然后，作者进一步将样本数量扩大到每组9例（年龄范围：20-30岁，平均：26.4岁）VS（年龄范围：70-80岁，平均：75.2岁），并证实了两组之间YTHDF1 mRNA水平的显著差异（图1B）。这些结果表明YTHDF1可能参与了骨质疏松症的发病机制。

然后作者测定了在成骨培养基中培养的hBMSCs中YTHDF1的mRNA表达谱。在成骨分化过程中，YTHDF1 mRNA表达显示出与碱性磷酸酶（ALP）相似但更早的分布。YTHDF1 mRNA水平增加，并在第3天达到峰值，然后略有下降，直到第14天。同时，细胞ALP表达升高，其峰值出现在第7天，略微落后于YTHDF1。ALP mRNA水平在第10天逐渐降低，并在第14天进一步略有下降（图1C, D）。这些数据表明YTHDF1基因在hBMSC成骨分化过程中以时间依赖性方式表达。

作者进一步观察了Ythdf1在Ythdf1基因敲除（KO）小鼠BMSCs谱系分配和骨代谢中的潜在作用。Ythdf1 KO小鼠是存活的，并且在12周龄时，与对照同窝出生小鼠相比具有相似的大小（图1E）。WB分析证实了Ythdf1 KO小鼠来源的BMSCs中Ythdf1的成功缺失以及野生型（WT）小鼠来源的BMSCs中成骨期间Ythdf1蛋白表达的增加（图1F）。对胫骨干骺端骨小梁进行微计算机断层扫描（μCT）分析显示，Ythdf1 KO小鼠总骨密度（BMD）低于WT小鼠（图1G），骨小梁体积与总体积比（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）的减小进一步证明了这一点，而Ythdf1 KO小鼠的骨小梁分离度（Tb.Sp）更高（图1H）。除了小梁表型外，与 WT 小鼠相比，Ythdf1 KO 小鼠还表现出皮质骨厚度（Ct.Th）轻度降低。
 

 

（2）YTHDF1参与hBMSCs成骨分化

为了确定YTHDF1在hBMSC成骨分化中的作用，作者在hBMSCs中进行了功能丧失/获得实验。使用shRNAs抑制YTHDF1表达，作者评估了三种shRNAs的敲除效率，并且在后续实验中使用了具有最佳效率的YTHDF1-shRNA3（图2A，B）。成骨诱导后72小时后，YTHDF1敲除导致hBMSCs中RUNX2、OSTERIX、ALP和骨钙素（OCN）的mRNA表达有限降低（图2C）。与对照组相比，敲除YTHDF1的hBMSCs中ALP和茜素红染色（ARS）强度减弱（图2D）。将pLVX-YTHDF1转染到培养的hBMSCs中实现YTHDF1过表达，并且在转染后72小时通过PCR和WB验证了YTHDF1 mRNA和蛋白质表达水平的升高（图2E，F）。在pLVX-YTHDF1转染后24小时，hBMSCs被诱导成为成骨细胞，与对照组相比，转染pLVX-YTHDF1的细胞ALP和ARS强度更强，并在成骨诱导72小时后，成骨细胞特异性基因的mRNA水平显著升高（图2G，H）。
 

 

（3）MeRIP-Seq和RIP-Seq鉴定ZNF839为YTHDF1下游靶点

对成骨诱导3天的hBMSCs和未处理的对照细胞进行m6A MeRIP-seq分析，以探索未处理的hBMSCs中m6A修饰的概况以及成骨过程中m6A在hBMSCs中的变化。通过成骨诱导组和对照组m6A MeRIP-seq，共检测到13815和16657个m6A峰，分别对应8012和8729个转录本。作者通过motif分析，发现最常见的m6A位点GGAC序列，在m6A峰中显著富集（诱导组p<1.7 e-10，对照细胞p<3.2e-11）（图3A）。为了证实m6A在转录物中的优先定位，作者进行了mRNA中m6A峰的相对位置的分析，发现m6A峰特别富集在3′-UTR区域的终止密码子附近（图3C）。考虑到m6A的动态调节在成骨分化过程中起作用，只有成骨过程中丰度发生改变的m6A峰被认为是真正的m6A峰。共检测到2303个基因发生了差异甲基化（p<0.00001），并对其进行了进一步研究。

作者通过m6A MeRIP-seq方法鉴定了所有发生修饰的mRNAs，但没有鉴定与YTHDF1结合的mRNAs。因此进一步通过RIP-Seq，以获得与YTHDF1结合的mRNAs，从而进一步识别其直接靶标。在该试验中使用YTHDF1基因敲除细胞，与YTHDF1结合亲和力降低的基因成为研究对象。在RIP-Seq中总共检测到534个在sh-YTHDF1下调的基因。为了深入了解这些与YTHDF1结合的基因的潜在功能，作者对这些发生m6A修饰且与YTHDF1结合的mRNAs进行了GO分析，观察到它们参与多种功能，包括细胞分化调控、成骨细胞分化调控和骨矿化调控（图3D，E），表明这些基因可能参与hBMSC成骨分化。共从m6A MeRIP-seq和RIP-Seq结果的交集获得132个基因（图3D）。在去除异常值后，作者选择了前10个相对高表达的基因：FOXD2、JDP2、LRRC32、DRAM1、ZNF839、SLC7A5、THBS1、ZSCAN2、BCR和HK2。ZNF839是YTHDF1识别的m6A修饰增加最多的基因，并且它在其翻译终止密码子附近具有高度富集和特异性的m6A峰（图3F）。作者还发现ZNF839及其小鼠同源物Zfp839是锌指蛋白，在全身组织中普遍表达，并在骨髓中高度表达（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/55778）。基于以上信息，作者推测ZNF839是一个与YTHDF1结合的m6A修饰基因，并在hBMSC成骨的调节中发挥作用，因此需要进一步研究。
 

 

（4）m6A“阅读蛋白”Ythdf1与Zfp839结合并促进带有m6A修饰的Zfp839 mRNA的翻译

作者进一步研究Zfp839是否受Ythdf1调控。在成骨3天后，评估对照组和Ythdf1 KO组BMSCs中Zfp839的mRNA和蛋白表达水平。通过WB检测到Ythdf1 KO组BMSCs中Zfp839蛋白水平的下调。相反，与对照组相比，BMSCs中Ythdf1的过表达显示出更高的Zfp839蛋白水平，尽管Zfp839的mRNA水平基本保持不变（图4A、B）。这些结果表明Ythdf1对Zfp839的调控发生在转录后。

然后，作者试图证实Zfp839的表达受Ythdf1以m6A依赖的方式调节。首先，作者使用哺乳动物m6A位点预测因子SRAMP搜索Zfp839中的m6A基序。用SRAMP程序对Zfp839 mRNA的分析预测了CDS上288、1067、1901、1673、2314、2542位点的6个高置信度m6A位点，以及773和779位点的2个非常高置信度m6A位点。为了进一步研究，作者同时在两个非常高的m6A位点（Zfp839-Mut）引入了同义突变（图4C）。

作者进行了m6A抗体的下拉实验，但与Zfp839-WT的细胞相比，未能从Zfp839-MT m6A的C3H10T1/2细胞下拉m6A突变的Zfp839 mRNA，表明Zfp839 mRNA中m6A修饰几乎完全缺失（图4D）。作者试图证实带有m6A修饰的Zfp839 mRNA是否可以被m6A“阅读器”Ythdf1识别和结合。为此，通过Ythdf1和Zfp839-WT/MT共转染C3H10T1/2细胞，并使用抗Ythdf1抗体进行RIP实验。结果表明，在共表达Ythdf1和Zfp839-WT的C3H10T1/2细胞中检测到Zfp839 mRNA，但在共表达Ythdf1和Zfp839-MT的细胞中没有检测到（图4E）。这些结果表明Ythdf1与Zfp839 mRNA的结合应该是m6A依赖性的。

为了验证Ythdf1的成骨促进功能是否通过Zfp839翻译增强来实现，作者敲除了过表达Ythdf1的BMSCs中Zfp839的表达。事先检测了Zfp839 shRNAs的转染效率。shRNA1显著降低了Zfp839 mRNA和蛋白质水平，而shRNA2和shRNA3没有显示出这种显著的效果（图S2A，B）。因此作者使用shRNA1进行了以下研究。ALP和茜素红染色显示，由Ythdf1过表达引起的小鼠BMSC成骨增强可通过敲低Zfp839消除（图4F）。用成骨特异性基因进行的PCR也显示了与染色试验相似的结果（图4G）。所有这些实验都证实了Ythdf1对BMSC成骨的作用是由其下游靶标Zfp839介导的。

为了进一步研究体内Ythdf1和Zfp839的关系，作者在WT和Ythdf1 KO小鼠的骨髓切片中进行了免疫染色。在WT组中检测到Ythdf1和Zfp839共定位，而在Ythdf1 KO组中几乎没有检测到，这表明Ythdf1和Zfp839可能在体内可能存在表达和功能上的相关性（图S3A）。
 

 

（5）Zfp839与Runx2相互作用促进BMSCs成骨

虽然作者证实了Ythdf1的成骨功能，以Zfp839作为其下游靶点，但Zfp839在BMSCs成骨分化中的确切作用仍有待阐明。作者进一步进行了功能获得和丧失实验，以确定Zfp839对成骨细胞分化的影响。将Zfp839 shRNA转染的小鼠BMSCs与成骨培养基培养3天，敲除Zfp839显著消除了成骨诱导下BMSCs中成骨特异性基因mRNA水平表达的增加（图5A）。ALP和茜素红染色测定的结果也表明敲除Zfp839降低了这些BMSCs的矿化作用（图5B）。通过将pLVX-Zfp839转染到小鼠BMSC中实现Zfp839过表达。在pLVX-Zfp839转染后72小时，通过PCR和WB验证转染效率（图S4A，B）。与敲除实验相反，pLVXZfp839转染的Zfp839过表达增强了BMSC成骨分化，成骨细胞基因表达的升高以及ALP和茜素红染色强度的增强都证明了这一点（图S4C，D）。所有这些结果都表明Zfp839在BMSC成骨中起着积极的作用。

作者发现在功能丧失/获得实验中，Zfp839过表达或敲除轻微影响Runx2的表达，但在BMSC成骨分化过程中强烈改变其下游成骨特异性基因（Alp、Osterix和Ocn）的表达。鉴于Runx2是在BMSC成骨过程中上调其下游成骨特异性基因的上游关键转录因子，这些结果促使作者推测Zfp839可能作为Runx2的辅助激活因子来增强其转录活性，而不是作为直接促进Runx2表达的上游因子。

此外，通过将Flag标记的Zfp839或Myc标记的Runx2共转染到HEK-293T细胞中来进行IP实验，然后提取蛋白质并用抗Myc或抗Flag抗体进行IP。如图5C所示，Zfp839可以直接与Runx2交互。此外，IP分析表明内源性Zfp839可以与MC3T3-E1细胞中的Runx2相互作用（图5D）。

作者进一步构建了含有成骨细胞特异性基因启动子区的报告质粒，并将这些质粒与Runx2共转染到293个T细胞中。荧光素酶报告基因分析表明，Zfp839单独的过表达不影响荧光素酶活性。单独Runx2的过表达激活了Alp、Osterix和Ocn启动子。然而，当Zfp839与Runx2共转染时，Runx2的转录活性显著增强，如在Alp、Osterix和Ocn启动子下荧光素酶活性显著增加所示（图5E）。为了研究Zfp839和Runx2在骨髓间充质干细胞成骨过程中的作用，作者还对诱导成骨72小时的骨髓间充质干细胞进行了免疫荧光染色。与对照细胞相比，Zfp839和Runx2在成骨诱导的BMSCs中的荧光强度增强，这表明Zfp839和Runx2可能是参与成骨的BMSCs细胞核中共定位的同一调节复合物的一部分（图5F）。总之，这些数据表明Zfp839通过与Runx2相互作用来调节成骨细胞特异性基因表达。
 

 

（6）YTHDF1缺失导致体内骨量降低

为了进一步验证 Ythdf1 在体内骨代谢中的作用，作者发现 Ythdf1 KO 小鼠的矿物质沉积率（MAR）和骨形成率（BFR）都比 WT 对照组小鼠低（图 6A），这表明 Ythdf1 KO 小鼠的骨形成率低于 WT 对照组。

此外，作者还在苏mu精和伊红（H&E）染色（图 6B）中检测到骨量减少，并在 Ythdf1 KO 小鼠的免疫组化切片中检测到Ⅰ型α-1链胶原蛋白（Col1a1）的减少（图 6C）。此外，还进行了耐酒石酸磷酸酶（TRAP）染色，发现两组的染色面积量化没有显著差异（图 6D），表明 Ythdf1 不影响破骨细胞的活性和骨吸收。此外，免疫荧光检测在 KO 组几乎检测不到 Ythdf1 的表达，Zfp839 的表达也有所降低（图 6E、F）。这些体内结果也表明，骨形成的迟缓可能是由于缺乏 Ythdf1 的 BMSCs 成骨分化能力减弱所致。
 

 

全文小结

 

本研究表明YTHDF1在hBMSC成骨分化中起着关键作用。其敲除减少了体外hBMSCs的成骨。在体内，Ythdf1 KO小鼠与它们的WT同窝出生小鼠相比显示出骨量减少。

本研究发现ZNF839为YTHDF1的下游靶标。ALP和ARS测定以及PCR分析结果表明，Zfp839可以增强BMSC成骨。

本研究通过IP实验和荧光素酶测定结果证实了Zfp839与Runx2的物理相互作用以及下游成骨特异性基因启动子荧光素酶活性的增加，表明Zfp839 可以作为 Runx2 的共激活剂增强BMSC成骨。

本研究发现锌指蛋白ZNF839/Zfp839由Ythdf1以m6A依赖的方式进行转录后调控。同时发现它作为一种新的辅激活因子，通过与主转录因子Runx2相互作用来增强BMSC成骨。这些发现为深入剖析BMSC成骨的分子机制提供了新的途径，并为代谢性骨病的治疗提供了潜在的靶点。
 

云序生物m6A修饰研究五大模块
 

01 m6A RNA修饰测序

m6A RNA修饰测序（m6A-MeRIP-seq）

对m6A RNA甲基化，目前流行的检测手段为m6A-MeRIP-Seq技术，适用于m6A RNA甲基化谱研究，快速筛选m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多种非编码RNA的m6A测序：

m6A 全转录组测序（涵盖mRNA，LncRNA，circRNA）

m6A  LncRNA测序（涵盖LncRNA和mRNA）

m6A  Pri-miRNA测序（涵盖Pri-miRNA和mRNA）

m6A  mRNA测序

m6A  miRNA测序

02 检测整体m6A RNA修饰水平

LC-MS/MS检测整体RNA修饰水平

精准高效，可以实现一次检测，9类修饰水平检测，一步到位。

比色法检测整体RNA修饰水平

快速检测m6A整体甲基化水平

03 m6A RNA修饰上游酶的筛选

m6A RNA修饰相关酶PCR芯片

寻找上游直接调控m6A RNA甲基化的甲基转移酶。

04 m6A RNA修饰靶基因验证

MeRIP-qPCR/GenSeq® MeRIP试剂盒

云序提供各类不同修饰的MeRIP-qPCR服务以及销售GenSeq® MeRIP试剂盒，可针对mRNA，lncRNA，环状RNA等不同类型的RNA分子进行检测，低通量验证RNA修饰靶基因表达水平。

05 机制互作研究

5.1 RIP-seq/qPCR/GenSeq® RIP试剂盒

筛选或验证RNA修饰直接靶点，研究RNA修饰靶基因的调控机制。

5.2 RNA pull down -MS/WB

筛选或验证目标RNA互作基因或蛋白，研究相应的分子调控机制。

5.3 ChIP-seq

筛选或验证目标蛋白与DNA互作，研究相应的分子调控机制。
 

云序生物服务优势
 

优势一：云序累计支持客户发表100 +篇RNA修饰SCI论文，合计影响因子1000 +

优势二：累计完成数千例 RNA甲基化测序样本，全面覆盖医口、农口等各类样本。

优势三：全面检测mRNA和各类非编码RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。

优势四：提供m6A一站式服务：m6A整体水平检测、m6A测序、MeRIP-qPCR验证、RIP和RNA pull-down等。

优势五：率先研发超微量MeRIP测序技术，RNA量低至500ng起。

优势六：RNA修饰测序平台，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙酰化和2'-O-甲基化测序。
 

云序客户RNA修饰部分文章列表
 

相关产品

m6A RNA甲基化测序

m5C RNA甲基化测序

m1A RNA甲基化测序

m7G RNA甲基化测序

ac4C RNA乙酰化测序

O8G RNA氧化修饰测序

2’-O-RNA甲基化测序

m6Am RNA甲基化测序

RNA pulldown

RNA-seq

RIP测序

 

往期回顾

云序客户m6A高分文章|揭示组蛋白乙酰化与m6A修饰在眼部黑色素瘤发生中的共同作用机制

客户文章| Nature子刊 揭示了FMR1通过m6A修饰调控早期胚胎发育的分子机制

用户文章m6A专题|IF=9.8|m6A去甲基化酶ALKBH5缺乏会加重钴致神经退行性损伤

1区，IF=27| 云序m6A MeRIP-seq助力鳞状细胞癌机制研究！

用户文章 1区 lncRNA m6A甲基化测序助力人脂肪干细胞成骨分化的调控机制研究

客户文章|1区，IF=9.995|m6A甲基化测序助力宫颈癌相关HPV病毒研究

用户文章IF=19.568|m5C修饰测序助力NSUN2调控病毒I型干扰素反应的机制研究

Nature 新发现：线粒体 m5C 修饰竟是肿瘤转移的元凶！

用户文章IF=14.9 1区：ac4C乙酰化调节人胚胎干细胞的自我更新

云序用户农口IF20+论文：植物mRNA存在ac4C新型修饰，对RNA稳定性及翻译产生重要影响

用户文章：m7G 甲基化参与调节心肌细胞增殖|新型RNA修饰研究

客户文章|新型RNA修饰之m7G揭示急性髓系白血病发病机制

云序用户植物文章6连发：植物当中各类RNA甲基化测序该怎么发?

庆祝云序用户m1A、m6A、m5C RNA甲基化测序文章三连发

 

上海云序生物科技有限公司

Shanghai Cloud-seq Biotech Co.，Ltd.

地址：上海市松江区莘砖公路518号18号楼2楼

电话：021-64878766

网址：www.cloud-seq.com.cn