转录组为特定细胞在某一功能状态下转录出来的所有RNA，主要包括mRNA，某些情况下也包括非编码RNA。转录组测序利用高通量测序技术，快速且全面地揭示某一物种特定细胞或组织在某一状态下的几乎所有转录本信息，包括转录本表达量、可变剪接体、可变polyA位点等。

转录组分析的核心目标是准确定量样品中RNA转录本的丰度。目前，基于测序的方法（如RNA-Seq）具有消除基因之间杂交偏差的优势，但在RNA测序过程中，实验操作、逆转录、加接头、仪器等及PCR过程中存在的序列扩增偏好性等因素，都会使得常规RNA-Seq的结果准确度下降。

那怎样实现RNA-seq的准确定量呢？

2012年PNAS报道了一种可以降低RNA-Seq偏倚和噪音的方法，也是我们常说的UMI-RNA-Seq。下面让我们了解一下UMI是如何发挥作用的。

什么是UMI-RNA-Seq？

RNA测序在构建文库时，需要进行PCR扩增，但是所有的片段并非以同等速率进行扩增，片段的长度、GC含量及浓度等都会影响扩增速率，最终导致容易扩增的片段被极大的富集，而一些含量较低或碱基偏好较低的片段富集很少，甚至丢失，从而影响测序结果的准确性。

UMI-RNA-Seq实验原理是通过在每个cDNA分子上连接一个特异序列标签（UMI，Unique Molecular Identifier），随后这些UMI会随cDNA序列一起扩增。在测序完成后，通过识别UMI，将具有相同UMI的重复片段合并，去除由于PCR扩增偏好性及测序仪引起的重复，达到一比一还原样本扩增前的原始状态，从而定量原始样本中转录本的数量。

UMI≠绝对定量测序！

与常规转录组测序相比，添加UMI标签，转录本测序定量的准确性确实能够实现大幅提高，但通过UMI-RNA-Seq就能真正的实现绝对定量测序吗？

根据上述UMI-RNA-Seq的原理，可以发现UMI标签能够很好的消除文库构建过程中PCR扩增及测序仪引起的偏好性和重复性。但在测序过程中，除了PCR扩增过程中产生的干扰，逆转录、加接头、上机量等实验过程中存在的问题以及数据量的差异也会影响RNA的定量，最终导致转录组测序准确性下降。因此仅仅通过UMI标签不能完全消除这些差异，也无法实现RNA的准确定量。

另外，对于多个样本的RNA-seq数据，通常还会利用组间的数据进行差异分析。差异分析的前提是每个样本的获得的原始数据量是相等的，而数据量的矫正仅通过UMI技术是很难实现的。因此，尽管添加了UMI标签，一些差异也无法消除，无法实现真正的绝对定量。

云序生物UMI + spike-in矫正实现“真”绝对定量RNA测序！！

为了弥补UMI-RNA-Seq方法无法消除的干扰问题，云序生物联合UMI与spike in矫正共同实现对转录组测序的精准定量！

Spike in是一种标准物，也称为外源性内标，是指在每个样品中加入等量的已知序列信息的非亲缘标准品基因组，与实验样品共同进行文库构建及测序。在进行分析时，通过不同样本间spike in的表达量，能够非常准确地对不同样本之间RNA的表达量进行矫正，消除样本间的由于实验操作及数据量引起的误差，很好的弥补了UMI无法消除的偏差，从而实现测序高准确性定量。

图注：使用spike in矫正前后数据的可视化

图：spike in的优势，From K.C et al. 2016

（a）当基因组各处都发生相同程度的变化时，将总测序reads归一化为相同的数字会隐藏变化，而将spike-in的reads归一化为相同的数字会揭示reads密度的全局变化。

(b)当特定基因组区域发生信号增加时，标准化样本之间的总测序reads会导致来自基因组其他区域的reads数量人为减少，这就会错误地解释为在特定实验条件下减少。而通过使用spike-in的reads作为标准化，可以避免这种人为的变化。

(c)甲基化DNA拷贝数的差异在使用spike-in标准化下可以被准确的分析，而样本中甲基化的比例在没有spike-in标准化下也可以正确分析。

绝对定量测序技术在MeRIP-Seq中的应用

Spike in除了能够进行数据的矫正之外，还能应用于MeRIP-seq中的实验质控环节。MeRIP-Seq是基于特异性抗体进行的免疫沉淀实验，抗体的选择是通过多项研究证明的有效性高、特异性好的抗体。但是一些客户可能还是会对抗体的有效性及MeRIP实验的可靠性有质疑。针对这种情况，云序生物提供MeRIP-seq实验中的spike in验证：通过在不同样品中添加等量的具有/不具有RNA修饰的非亲缘标准品基因组，验证实验的可靠性。

图注：基于spike in的数据质控

（左：带有修饰的spike in；右：不带修饰的spike in）

 

目前，在云序生物m6A修饰的相关测序服务中已经全面添加spike in，对于其他RNA修饰，如m5C、m7G、ac4C、m1A等，云序生物也可提供spike in的添加，为客户提供数据有效性的保障！（具体咨询相关销售）

云序生物“真”绝对定量RNA测序技术适用范围及优势

云序生物绝对定量RNA测序技术（UMI+spike in）适用于全转录组测序、mRNA测序、LncRNA测序、circRNA测序等多种转录组测序，同时也适用于多种RNA修饰的MeRIP测序（m6A、m5C、ac4C和m7G等）。

技术优势1. 测序结果更准确！

云序生物通过在文库构建时加入UMI标签以及spike-in共同矫正测序偏差，得到测序结果更准确！

技术优势2. 差异分析更可信！

云序生物通过绝对定量测序对不同样本间RNA表达量进行高准确性矫正，使得不同样本差异比较更可信，同时可以无偏差应用于不同样本。

技术优势3. 测序结果更稳定！

云序生物通过绝对定量测序可以更好的减少样品用量以及技术误差等影响，使得测序结果更稳定。

云序生物服务优势

优势一：云序累计支持客户发表100+篇RNA修饰SCI论文，合计影响因子 1000+。

优势二：累计完成上万例RNA甲基化测序样本，全面覆盖医口、农口等各类样本。

优势三：全面检测mRNA和各类非编码RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。

优势四：提供m6A一站式服务：m6A RNA修饰整体水平检测、m6A测序、MeRIP-qPCR验证、RIP和RNA pull-down、Ribo-seq、CHIP-seq等技术服务。

优势五：率先研发超微量MeRIP测序技术，RNA量低至500ng起。

优势六：国内最全的RNA修饰测序平台，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙酰化、2'-O-甲基化测序和假尿嘧啶修饰测序。

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