近日，卡塔林·考里科（Katalin Karikó）和德鲁·韦斯曼（Drew Weissman）获得2023年诺贝尔生理学或医学奖，以表彰他们在核苷碱基修饰方面的发现。20世纪80年代，人们引入了一种无需细胞培养就能产生mRNA的有效方法，称为体外转录，将mRNA技术用于疫苗和治疗的想法也开始兴起。但体外转录的mRNA不稳定，需要复杂的载体脂质系统来封装。此外，体外产生的mRNA会引起炎症反应。然后这些并不能阻止匈牙利生物化学家卡塔琳·考里科致力于开发基于mRNA的疗法。他们发现，当mRNA中包含碱基修饰时（假尿苷 (ψ)、5-甲基胞苷 (m5C)、N6-甲基腺苷 (m6A)、5-甲基尿苷 (m5U) 或 2-硫尿苷 (s2U)），炎症反应几乎消失了。2005年，他们在《免疫》杂志上发表了这一开创性的成果。在2008年和2010年，考里科和韦斯曼发现，与未修饰的mRNA相比，碱基修饰产生的mRNA的传递显著增加了蛋白质产量。这些发现使针对新冠感染的有效信使核糖核酸（mRNA）疫苗的开发成为可能。

云序生物可提供：假尿嘧啶修饰测序（BID-seq）、5-甲基胞苷 ( m5C MeRIP-seq)、N6-甲基腺苷 (m6A MeRIP-seq)、等多种核酸修饰测序服务。

图1：碱基修饰的体外转录 mRNA 表达更高的蛋白质。产生碱基修饰的体外转录 mRNA，其中尿苷 (U) 被假尿苷 (Ψ) 取代。当碱基修饰的 mRNA 被引入细胞时，与未修饰的 mRNA 相比，观察到蛋白质产量增加。

科学背景

当 SARS-CoV-2 于 2019 年底出现并迅速传播到世界各地时，很少有人想到可以及时开发出疫苗来帮助遏制日益增加的全球疾病负担。然而，多种疫苗在创纪录的时间内获得了批准，其中两种批准速度最快且最有效的疫苗是采用新的 mRNA 技术生产的。使用 mRNA 进行疫苗接种和体内递送治疗性蛋白质的概念于 30 多年前首次提出，但必须克服几个障碍才能使其成为临床现实。早期实验表明，体外转录的 mRNA 会刺激细胞和组织中不良的炎症反应和低效的蛋白质生产。Karikó 和 Weissman 的发现是一个转折点，证明用修饰的核苷碱基产生的 mRNA 可以逃避先天免疫识别并改善蛋白质表达。这些发现，再加上体内 mRNA 递送的有效系统的开发、SARS-CoV-2 刺突抗原的稳定性以及行业和政府的投资，导致两种非常成功的基于 mRNA 的 COVID-19 疫苗在2020 年底获得批准。Karikó 和 Weissman 的发现对于使 mRNA 疫苗平台在最需要的时候适合临床使用至关重要，使其对医学做出非凡贡献，并为未来 mRNA 应用铺平道路。

COVID-19之前的病毒疫苗平台

减毒活病毒疫苗：目前大多数获得许可的抗病毒疫苗都是采用基于弱化或灭活的完整病毒的传统技术生产的。例如风疹-腮腺炎-麻疹联合疫苗和黄热病病毒疫苗，可诱导强效且长效的抗体和 T 细胞介导的免疫。马克斯·泰勒因开发黄热病病毒疫苗而获得 1951 年诺贝尔生理学或医学奖。基于灭活病毒的疫苗，例如蜱传脑炎疫苗和甲型肝炎疫苗，可诱导有效但更短暂的免疫响应，需要反复增强。

亚单位疫苗：随着分子生物学的革命和重组蛋白生产技术的发展，出现了更有针对性的疫苗方法的机会。第一种使用这种方法生产的疫苗是 1986 年批准的乙型肝炎疫苗 (HBV)，随后于 2006 年批准了第一种人乳头瘤病毒 (HPV) 疫苗。HBV 和 HPV 疫苗含有各自的单一蛋白质成分病毒，被称为亚单位疫苗。这些疫苗可以预防病毒引起的癌症，是挽救生命的成功案例。

病毒载体疫苗：此类病毒载体有效地进入细胞，其中内源蛋白质合成机器产生编码的抗原。第一个获得许可的病毒载体疫苗的例子是基于水泡性口炎病毒的埃博拉疫苗，于 2019 年获得批准，随后不久又推出了基于腺病毒的埃博拉疫苗。

图2：COVID-19 大流行之前的疫苗生产方法。目前使用的疫苗是由弱化或灭活的完整病毒、重组病毒蛋白成分（亚单位疫苗）或传递感兴趣抗原的病毒载体（载体疫苗）制成的。疫苗接种活动会刺激抗原特异性免疫反应，如果接种疫苗的人随后接触活病原体，则可以提供保护。

核酸和病毒载体的疫苗研究与应用

首次证明基于核酸的免疫接种可以发挥作用可以追溯到 1990 年代初期，当时 DNA 疫苗 和 mRNA 疫苗首次在小鼠身上进行了测试。这些方法有几个潜在的优势。核酸疫苗不仅易于制造，而且易于生产。可以轻松改变序列以编码不同的抗原。再加上生产的便利性，这使得新候选疫苗的迭代测试和更新疫苗的生成变得快速高效。然而，尽管核酸疫苗具有潜在优势，但它们是否具有良好的耐受性并刺激人类足够强大的免疫反应以代表临床疫苗开发的可行途径尚不清楚。

最初，DNA 疫苗被认为比 mRNA 疫苗更有前景，因为 DNA 更稳定。然而，进展缓慢，一个可能的原因是注射的 DNA 必须穿过质膜和核膜这两个屏障，才能到达发生转录（DNA 转化为 mRNA）的细胞区室。相比之下，基于 mRNA 的疫苗只需要进入发生翻译的细胞质（mRNA 转化为蛋白质），从而使递送更容易。mRNA 疫苗的另一个优点是所传递的核酸无法整合到宿主基因组中，从而为该平台增加了重要的安全性。尽管有这些优点，但人们对该方法的实用性仍然抱有很高的怀疑态度，因为 mRNA 被认为对于医学应用来说太不稳定。在这种背景下，疫苗领域转向使用工程病毒载体，因为这些载体有其自身的内在机制来进入细胞并传递遗传物质。自 20 世纪 90 年代以来，针对多种病原体的许多不同类型的基于病毒载体的疫苗已经过临床测试，基于病毒载体的疫苗的缺点是，除了针对感兴趣的抗原引发所需的反应之外，还可能诱导针对用于包装载体的结构蛋白的抗体，如果再次使用相同的载体，则会损害加强反应。尽管如此，在 COVID-19 大流行期间开发了使用不同类型的工程腺病毒的疫苗，并进行了大规模施用，在大流行的早期阶段证明了它们的有用性。

mRNA 和体外转录系统的发现

为了探索基于 mRNA 的应用的潜力，需要一种有效的 mRNA 生产和操作系统。为此，该领域依赖于 20 世纪 50 年代开始的一系列基础研究发现。在DNA作为遗传物质这一具有里程碑意义的发现之后，人们开始寻找从核DNA转录并转运到细胞质中的核糖体以指定蛋白质合成的中间分子。对感染 T2 噬菌体的细胞进行的实验发现，具有代谢活性的 RNA 部分约占细胞总 RNA 的 1%，且具有适当的碱基比率。这种不稳定形式的 RNA 或信使 RNA (mRNA) 被认为是缺失的信息中间载体，并且该假设很快通过细菌中的脉冲标记实验获得了实验支持。大约在同一时间，通过 RNA 聚合酶的发现，人们深入了解了细胞如何从 DNA 产生 RNA。在接下来的几十年里，在细菌和真核细胞中鉴定出了几种 RNA 聚合酶，包括来自 T7 和 SP6噬菌体的单亚基 RNA 聚合酶。

在发现更通用的噬菌体 RNA 聚合酶的基础上，Paul Krieg 和 Douglas Melton 证明，通过使用 SP6 RNA 聚合酶和含有 SP6 启动子的 cDNA 克隆，可以在体外大量生产合成 mRNA。此外，体外产生的 SP6 mRNA 在注射到青蛙卵母细胞中时可以有效翻译为蛋白质。大约在这个时候，William Studier 的实验室克隆了 T7 RNA 聚合酶，并开发成一种高效、可诱导的体外转录系统，并于 1984 年申请了专利 。

另一个重要的研究领域集中在如何将核酸输送到细胞中。早期的策略是使用脂质体，即由磷脂和胆固醇组成的小细胞膜状囊泡。早在 1978 年，研究人员就已经成功尝试使用脂质体将纯化的珠蛋白 mRNA 传递到小鼠淋巴细胞和人类上皮细胞中，只需将 mRNA 捕获在脂质体囊泡内即可。然而，脂质转染剂的体内应用显示出不良副作用，研究人员继续寻找改进的递送系统。

使用 mRNA 传递治疗性蛋白质的愿景

使用新的分子生物学技术来创建基于 mRNA 的疫苗或通过传递 mRNA 用功能性基因替换有缺陷的基因或通过过表达治疗性蛋白质来治疗人类疾病的潜力激发了人们的巨大兴趣。Karikó 对推进 mRNA 平台有着强烈的推动力，她系统地研究了体外转录 mRNA 的不同成分，以确定细胞和组织中最佳蛋白质表达的要求。在多项发现中，她证明了编码荧光素酶的 lipofectin 复合 mRNA 可以被递送至大鼠大脑，并且表明，当在 mRNA 3' 末端添加更长的聚 (A) 尾时，表达会得到改善。受到这些结果的鼓舞，Karikó 继续探索使 mRNA 平台适合临床使用。

20 世纪 90 年代末，Karikó 与 Drew Weissman 合作，他们一起测试了是否可以将体外转录的 mRNA 传递至树突状细胞，以利用其抗原呈递潜力。Weissman的一个主要目标是开发一种针对 HIV-1（一种引起慢性感染的病毒）的疫苗。鉴于该病毒具有广泛的免疫逃避特性，使其有别于引起急性感染的病毒，这是一个特殊的挑战。Weissman 对使用树突状细胞来启动抗原特异性 T 细胞感兴趣，并开发了培养树突状细胞并评估其激活和抗原呈递能力的系统。树突状细胞具有感知病原体和启动T 细胞的精湛能力，因此它们在先天性和适应性免疫系统之间架起桥梁。

观察到树突状细胞在吸收体外转录的 mRNA 后被激活，这引发了关于哪些信号通路参与的关键问题？树突状细胞表达表面和内体 Toll 样受体 (TLR)，其识别称为病原体相关分子模式 (PAMP) 的不同分子结构。TLR 与 PAMP 结合导致细胞内信号传导和抗病毒细胞因子（包括 1 型干扰素）的产生，这是检测传入病原体的有效预警系统。在 Hemmi 等人发表论文之后，关于 TLR 如何区分不同形式的核酸的研究得到了关注。研究表明，未甲基化的 CpG 基序可激活 TLR9。

几年内，大多数核酸感应 TLR 的配体已被确定，包括感应病毒复制中间体双链 RNA（dsRNA）的 TLR3，以及感应单链病毒 RNA 和某些形式合成 RNA 的 TLR7 和 TLR8。2004 年，Karikó 和 Weissman 报告说，体外转录的 mRNA 含有 dsRNA 杂质，可激活 TLR3，导致细胞因子反应。Koski 、Karikó 和 Weissman 与 Brian Czerniecki 及其同事共同证明，用体外转录的 mRNA 转染树突状细胞可刺激细胞因子反应，这种反应与原核 RNA 所观察到的反应类似，从而获得了另一条重要线索。通过实验操作增加体外转录 mRNA 的 poly(A) 长度会显著减少 IL-12 的产生。然而，这并不能完全解释所观察到的效果。当使用 IL-12 作为直流激活的读出因子测试四种同源多聚核苷酸，即多尿苷酸（pU）、多鸟苷酸（pG）、多胞苷酸（pC）和多腺苷酸（pA）时，只有 pU 能引起反应，这表明核苷酸含量也起了作用。同年，雷斯-索萨（Reis e Sousa）小组在研究 TLR7 对 RNA 的识别时，使用干扰素α作为读出因子，也报告了类似的发现。

Kariko、Weissman 的重大突破

Karikó 和 Weissman 继续对不同类型的 RNA 进行仔细研究，并于 2005 年发表了突破性的论文。该研究描述了 mRNA 碱基修饰对树突状细胞细胞因子反应的影响。他们表明，碱基修饰丰富的真核 mRNA 和 tRNA 不会刺激细胞因子反应，而原核和体外转录的 mRNA 则会刺激细胞因子反应。他们进一步表明，将假尿苷 (ψ)、5-甲基胞苷 (m5C)、N6-甲基腺苷 (m6A)、5-甲基尿苷 (m5U) 或 2-硫尿苷 (s2U) 掺入体外转录的 mRNA 中，可消除炎症反应的激活。

图 3. 对体外转录的 mRNA（有或没有碱基修饰）和转染至原代树突细胞的评估。

(a) T7体外转录系统用于产生具有规范RNA碱基（A、U、G和C）或修饰碱基的mRNA；

(b) 显示了用于 RNA-1571 体外转录的碱基，未导致 TNF-α 分泌的碱基以橙色表示

迄今为止，研究人员已经发现了 100 多种不同的 RNA 转录后修饰，并表明真核生物的 RNA 修饰比原核生物更广泛。假尿苷 (ψ) 于 1951 年被发现，是最丰富的 RNA 修饰之一，最初在 tRNA 和小核 RNA (snRNA) 中发现，最近在其他类型的 RNA 中发现。细胞通过酶促反应修饰 RNA，例如假尿苷合成酶或使用小核糖核蛋白 (snoRNP) 复合物催化假尿苷 (ψ) 。RNA 修饰有助于 RNA 稳定性、碱基配对特异性、折叠和其他功能特性。

Karikó 和 Weissman 的发现解释了 Isaacs 及其同事 40 多年前的一项观察结果，该观察结果表明，将脱氨基 RNA 递送到细胞中会导致比对照 RNA 更强的 1 型干扰素反应。脱氨基作用增加了 RNA 中尿苷的比例，Kariko 和 Weissman 证明这对于 DC 激活至关重要。

Karikó 和 Weissman突破性地发现，修饰碱基的掺入可以避免体外转录 mRNA 产生的不需要的免疫激活，随后证明，含有假尿苷的 mRNA 也能更有效地翻译，从而在摄取 mRNA 的细胞中产生更高的蛋白质产量。在同一项研究中，他们表明将修饰的 mRNA 递送到小鼠的脾脏中会导致蛋白质产量增加并减少免疫激活，这是未来治疗应用的重要证明。

mRNA 疫苗的时机已经成熟

2020 年初疫情爆发时，mRNA 公司迅速采取行动开发 COVID-19 疫苗。BioNTech 和 Moderna 选择使用基于 Karikó 和 Weissmann 发现的经过修饰的 mRNA。BioNTech 以 Uğur Şahin 和 Özlem Türeci 为首，与辉瑞合作，而 Moderna 与 VRC/NIH 密切合作，Barney Graham 和一个组装团队进行了疫苗评估。在各国政府、国际组织和行业的集体资助和支持下，在创纪录的时间内完成了疫苗安全性和有效性试验，辉瑞/BioNTech 和 Moderna 的 mRNA 疫苗在 SARS-CoV-2 爆发一年内就获得了批准。这一发展得益于数十年的基础研究和 mRNA 平台的优化。

自 2021 年以来，多种 COVID-19 疫苗为拯救生命和减轻医疗保健系统的不可持续压力做出了贡献。mRNA 技术是对可用于疫苗生产的平台库的重要补充，尤其是在可扩展性的情况下应对流行病和灵活性至关重要。过去几年两种COVID-19 mRNA疫苗的广泛使用证明了该技术的巨大潜力。

总 结

2020年底，两种有效且安全的COVID-19 mRNA疫苗获得批准，推动mRNA疫苗领域进入了新时代。RNA修饰可以避免不需要的炎症反应并增加递送到细胞后的蛋白质产量，这一发现证明了基础研究的价值。Karikó 和 Weissman 在 2005 年的开创性论文中发表的结果当时几乎没有受到关注，但却为在 COVID-19 大流行期间为人类服务的至关重要的发展奠定了基础。

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比色法检测整体RNA修饰水平

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