组蛋白乙酰化是基因调控的重要表观遗传标记，n6 - methylladenine (m6A) RNA 修饰也是最常见的 RNA 修饰，尽管人们对组蛋白乙酰化和 m6A 修饰在肿瘤发生调控中的作用进行了大量的研究，但目前对这两种基本修饰之间的相互作用缺乏全面的了解。

2023 年 7 月 19 日，云序生物客户：上海交通大学医学院附属第九人民医院眼科范先群院士、贾仁兵教授、柴佩韦博士为文章通讯作者，庄艾等为第一作者，以「Targeting histone deacetylase suppresses tumor growth through eliciting METTL14-modified m⁶A RNA methylation in ocular melanoma」为题在《Cancer Communication (Lond)》杂志发表研究论文，该研究以黑色素瘤细胞和正常黑色素细胞系为对象，通过 m6A MeRIP-seq、RNA-seq、CUT&Tag、单细胞测序等多组学分析。揭示 HDACis 通过协调 m⁶A 修饰来发挥抗癌作用，从而揭示眼部黑色素瘤中 HDAC/METTL14/FAT4 表观遗传级联的「组蛋白-RNA 互作」反应。
 

发表期刊：Cancer Communications

影响因子：16.6  Q1

发表时间：2023年7月19日

研究方法：m6A MeRIP-seq、RNA-seq、CUT&Tag、单细胞测序

文章链接：Targeting histone deacetylase suppresses tumor growth through eliciting METTL14-modified m⁶A RNA methylation in ocular melanoma

 

技术路线

 

 

材料方法

 葡萄膜黑色素瘤细胞（MEL290，OMM2.3和OMM1）
人结膜黑色素瘤细胞（CRMM1，CRMM2和CM2005.1）
葡萄膜黑色素瘤细胞系MUM2B
葡萄膜黑色素瘤细胞系92.1
人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19
皮肤黑色素瘤细胞系（A375和SK28）
正常人黑色素细胞系PIG1

全文摘要

首先进行组蛋白修饰抑制剂 HDACis 对眼部黑色素瘤的抑制作用研究。使用 Dot blot 法检测整体 m⁶A RNA 修饰水平。

利用 RNA-seq、CUT&Tag、单细胞测序、甲基化 RNA 免疫沉淀测序（m6A MeRIP-seq）和 m⁶A 单核苷酸分辨交联和免疫沉淀测序 (miCLIP-seq)，以揭示 HDACis 对眼部黑色素瘤中甲基转移酶（METTL14）和 FAT 肿瘤抑制同源物 4（FAT4）的作用机制。

采用实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）、western blotting 和免疫荧光染色法检测 METTL14 和 FAT4 在眼黑色素瘤细胞和组织中的表达。

建立细胞模型和异种原位移植 (Orthotopic Xenograft) 肿瘤模型以鉴定 METTL14 和 FAT4 在眼部黑色素瘤生长中的作用。

采用 RIP-qPCR、m6A MeRIP-seq、miCLIP-seq 和 RNA 稳定性实验来研究 FAT4 对 m⁶A 水平的作用机制。
 

研究结果

1、HDACis 对眼部黑色素瘤具有肿瘤选择性攻击作用

为了分析表观遗传药物的临床潜力，本研究对245种表观药物进行了高通量抑制剂库筛选。经过第一轮筛选和第二轮验证，筛选验证结果揭示三种组蛋白去乙酰化抑制剂(HDACis) 表现出肿瘤选择性抑制，选择性指数>5，分别是LBH589、RG2833和LMK-235。在3个HDACis中，LBH589在眼部黑色素瘤细胞中表现出最高的选择性指数（>10）和最低的IC50值。表明LBH589在治疗眼部黑色素瘤方面表现出高效和低毒性。

为了验证LBH589在体内诱导的抑制作用，通过带有荧光素酶标签的92.1细胞建立了眼部黑色素瘤异种原位移植肿瘤模型。动物成像显示，与对照组相比，LBH589处理组表现出生物发光信号和肿瘤体积均降低。表明LBH589在体外和体外选择性地抑制眼部黑色素瘤。
 

 

2、HDAC通过诱导METTL14表达激活m⁶A修饰

为分析 LBH589 的下游靶标，研究对 LBH589 处理的 92.1 细胞进行高通量转录组分析（RNA-seq），RNA-seq 数据显示，2841 个基因表达上调，2086 个基因表达下调。下调基因主要富集在细胞周期、细胞分裂和 DNA 复制过程中，支持在眼部黑色素瘤中观察到的 LBH589 诱导的抑制表型。大多数上调基因（1776/2841，62.5%）表现出差异 m⁶A 甲基化水平（m6A MeRIP-seq 和 miCLIP-seq 数据），表明 HDAC 抑制可能调控整体 m⁶A 甲基化模式。随后利用 dot blot 法检测整体 m⁶A 甲基化水平，结果揭示黑色素瘤细胞中的 m⁶A 甲基化水平低于正常黑色素细胞，这与黑色素瘤中的其他 m⁶A 发现一致。研究发现经 LBH589 处理后，眼部黑色素瘤细胞中的整体 m⁶A 甲基化增加，表明 HDAC 抑制可恢复眼部黑色素瘤中 m⁶A 甲基化水平。

随后，作者探索了 LBH589 诱导 m⁶A 甲基化激活的分子机制。对 m⁶A 相关修饰酶包括 writer 蛋白（METTL3、METTL14 和 WTAP）、eraser 蛋白（ALKBH5 和 FTO）和 reader 蛋白（YTHDF1-3）的 RNA-seq 数据进行分析。分析结果表明，METTL14 在 LBH589 处理的黑色素瘤细胞中显著增加，其他与 m⁶A 相关的修饰酶保持不变。且 METTL14 在 mRNA 和蛋白水平上均被激活。这些数据表明 HDAC 抑制诱导了 METTL14 的显著上调，导致眼部黑色素瘤中整体 m⁶A 甲基化水平的激活。
 

 

3、METTL14 在眼部黑色素瘤中低乙酰化

由于 METTL14 参与 LBH589 介导的 m⁶A 激活，作者分析了眼部黑色素瘤中的 METTL14 乙酰化状态和表达水平。结果揭示了与正常色素细胞相比，眼部黑色素瘤细胞在 METTL14 启动子中表现出降低的 H3K27Ac 和 H3K9Ac 丰度。且 HDAC 抑制进一步增加了眼黑色素瘤细胞中 METTL14 的 H3K27Ac 和 H3K9Ac 水平。研究结果表明 METTL14 在眼部黑色素瘤中低乙酰化，但这种低乙酰化可以通过 HDAC 抑制来回复。
 

 

4、FAT4 是 METTL14 的下游标靶基因

作者研究了 METTL14 在眼部黑色素瘤中的抑癌作用机制。使用多组分析鉴定了三个符合以下标准的基因（CRYBG3、FAT4、SEMA3D）：在 METTL14 过表达后上调（蓝色圆圈，GSE215095）、在 LBH589 处理后上调（棕色圆圈，GSE214457），与 TCGA 队列中的 METTL14 呈正相关（红色圆圈，R>0.3，P<0.05），且在 m⁶A 修饰水平低的肿瘤中下调（绿色圆圈，GSE176345）（黄色圆圈，GSE137675）。在这三个基因中，只有 FAT4 表现出预后价值，且在 TCGA 队列中与 METTL14 平行表达（R = 0.471，P<0.001）。如 RNA-seq 可视化图所示，METTL14 过表达和 LBH589 处理后，FAT4 表达显著增加。且 FAT4 表达由 LBH589 处理诱导，在 RNA 和蛋白水平上与 METTL14 表达正相关。总之，研究结果表明 FAT4 可能参与 METTL14 介导的眼部黑色素瘤的肿瘤抑制。
 

 

5、FAT4 在眼部黑色素瘤中的抑癌作用

尽管 FAT4 在许多癌症中是一种传统的抑癌因子，但其在眼部黑色素瘤中的功能仍然是个谜。本研究检测了眼部黑色素瘤样品和细胞系中的 FAT4 表达。与 METTL14 类似，眼部黑色素瘤临床样本中的 FAT4 水平显著降低，与复发率降低相关。FAT4 的 RNA 和蛋白水平在眼部黑色素瘤细胞系中也降低。为了评估 FAT4 在 METTL14 介导的肿瘤抑制中的作用，作者在 METTL14 过表达的眼部黑色素瘤细胞系中沉默 FAT4 表达，结果表明 FAT4 敲除减弱了 METTL14 介导的肿瘤抑制，包括细胞聚落形成能力和转移能力。在异种原位移植肿瘤模型中，FAT4 沉默消除了 METTL14 过表达诱导的肿瘤抑制。总之，这些结果表明 FAT4 参与了由 METTL14 介导的眼部黑色素瘤抑制网络。
 

 

6、YTHDF1 识别 m⁶A 修饰增强了 FAT4 的 RNA 稳定性

由于 METTL14 是 m⁶A 修饰的甲基化转移酶（writer），作者研究了 METTL14 是否以 m⁶A 修饰依赖性方式调控 FAT4 表达。利用 miCLIP-seq（图 6A）和 m6A MeRIP-seq（图 6B）分析结果发现，眼黑色素瘤细胞系中的 FAT4 发生了低甲基化，与这些细胞中 METTL14 低水平表达一致。此外 RIP 分析发现 FAT4 在眼部黑色素瘤细胞中 m⁶A 显著低甲基化。外源性 METTL14 表达进一步增加了 FAT4 的 m⁶A 甲基化水平。总的来说，这些数据表明，METTL14 负责催化 FAT4 mRNA 的 m⁶A 甲基化。

由于 YTHDF 家族蛋白负责识别 m6A 甲基化，而 m6A 甲基化在决定其 RNA 命运中发挥着重要作用，因此我们探究了这些「Reader」在 FAT4 调控中的作用。利用 RIP-PCR，我们发现 FAT4 mRNA 在正常黑素细胞和 mettl14 过表达的眼部黑素瘤细胞中都特异性地与 YTHDF1 结合，而在其他 reader 蛋白 (YTHDF2 和 3) 与 FAT4 mRNA 之间观察到微弱的相互作用信号 (图 6C)。因此，沉默 YTHDF1 显著抑制了 FAT4 的表达，而在 ythdf2 /3 沉默的细胞中 FAT4 的表达保持不变 (图 6D)。有趣的是，外源性 METTL14 表达增加了 FAT4 mRNA 的稳定性，这与 METTL14 过表达细胞中 FAT4 表达的升高有关 (图 6E，紫色)。此外，YTHDF1 的沉默显著削弱了 FAT4 RNA 的稳定性 (图 6E，棕色)，并破坏了 mettl14 介导的功能 (图 6E，绿色)。有趣的是，FAT4 与 YTHDF1 显著正相关 (R = 0.359, P <0.001)。
 

全文总结

研究结果首先表明了眼部黑色素瘤细胞对 HDACis 的易感性。HDACis 触发眼黑色素瘤中 m⁶A RNA 修饰的升高。进一步的研究表明，METTL14 是 HDACis 的下游候选基因。METTL14 在组蛋白低乙酰化状态下沉默，而 HDACi 恢复了 METTL14 的正常组蛋白乙酰化水平，从而诱导其表达。随后，METTL14 通过 m⁶A-YTH N⁶-甲基腺苷 RNA 结合蛋白 1 依赖性方式促进肿瘤抑制因子 FAT4 表达，从而发挥肿瘤抑制作用。总之，本文揭示了 HDACi 恢复 METTL14 的组蛋白乙酰化水平，并随后在肿瘤发生过程中调控 METTL14 介导的 m⁶A 修饰。

这些结果表明，HDACis 通过协调 m⁶A 修饰发挥抗癌作用，揭示了眼黑色素瘤中 HDAC/METTL14/FAT4 表观遗传级联的「组蛋白-RNA 互作」。

 
云序生物 m6A 修饰研究五大模块

01 m6A RNA 修饰测序

m6A RNA修饰测序（m6A-meRIP-seq）

对m6A RNA甲基化，目前流行的检测手段为m6A-MeRIP-Seq技术，适用于m6A RNA甲基化谱研究，快速筛选m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多种非编码RNA的m6A测序：

m6A 全转录组测序（涵盖mRNA，LncRNA，circRNA）

m6A  LncRNA测序（涵盖LncRNA和mRNA）

m6A  Pri-miRNA测序（涵盖Pri-miRNA和mRNA）

m6A  mRNA测序

m6A  miRNA测序

02 检测整体m6A RNA修饰水平

LC-MS/MS检测整体RNA修饰水平

精准高效，可以实现一次检测，9类修饰水平检测，一步到位。

比色法检测整体RNA修饰水平

快速检测m6A整体甲基化水平

03 m6A RNA修饰上游酶的筛选

m6A RNA修饰相关酶PCR芯片

寻找上游直接调控m6A RNA甲基化的甲基转移酶。

04 m6A RNA修饰靶基因验证

MeRIP-qPCR/GenSeq® MeRIP试剂盒

云序提供各类不同修饰的meRIP-qPCR服务以及销售GenSeq® MeRIP试剂盒，可针对mRNA，lncRNA，环状RNA等不同类型的RNA分子进行检测，低通量验证RNA修饰靶基因表达水平。

05 机制互作研究

5.1 RIP-seq/qPCR/GenSeq® RIP试剂盒

筛选或验证RNA修饰直接靶点，研究RNA修饰靶基因的调控机制。

5.2 RNA pull down -MS/WB

筛选或验证目标RNA互作基因或蛋白，研究相应的分子调控机制。

5.3 ChIP-seq

筛选或验证目标蛋白与DNA互作，研究相应的分子调控机制。

 

云序生物服务优势

优势一：云序累计支持客户发表100 +篇RNA修饰SCI论文，合计影响因子1000 +

优势二：累计完成上万例 RNA甲基化测序样本，全面覆盖医口、农口等各类样本。

优势三：全面检测mRNA和各类非编码RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。

优势四：提供m6A一站式服务：m6A整体水平检测、m6A测序、MeRIP-qPCR验证、RIP和RNA pull-down等。

优势五：率先研发超微量MeRIP测序技术，RNA量低至500ng起。

优势六：国内较全的RNA修饰测序平台，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙酰化和2'-O-甲基化、假尿嘧啶RNA测序。

 

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