ac4C RNA 乙酰化是在 RNA ac4C 修饰酶的作用下，使 N4 位乙酰胞嘧啶发生乙酰化的一种保守的化学修饰（N4-acetylcytidine）。早期研究发现该修饰存在于真核生物中丝氨酸及亮氨酸 tRNA 和 18S rRNA 上，导致 Watson-Crick 碱基热稳定性增加，调控蛋白合成中的编码准确性；近期研究发现 ac4C 分布在人类转录组中，大多数位点出现在编码序列（CDS）内，并且通过改善 mRNA 的稳定性和翻译促进靶基因表达。NAT10 催化的 ac4C 通过促进 mRNA 的稳定性，成为编码转录组中一个重要的转录后调节因子。然而，它在哺乳动物发育中的作用尚不清楚。

云序客户北京大学基础医学科学院李扬科研团队通过云序生物提供的 acRIP-seq、LC-MS/MS 等技术，发现核心多能性调节因子 OCT4 是人胚胎干细胞（hESC）自我更新维持过程中独特且显著的 NAT10 应答的 ac4C 修饰靶基因，揭示了 NAT10 在维持 hESC 自我更新中的作用。该研究成果以「NAT10-mediated N4-acetylcytidine mRNA modification regulates self-renewal in human embryonic stem cells」为题发表在《Nucleic Acids Research》杂志上。

论文题目：NAT10-mediated N4-acetylcytidine mRNA modification regulates self-renewal in human embryonic stem cells
发表期刊：Nucleic Acids Research
影响因子：14.9/Q1
发表时间：2023 年 7 月 27 日
期刊ISSN：0305-1048
研究方法：acRIP-seq、acRIP-qPCR、LC-MS/MS等 1、高通量测序显示 ac4C 修饰在 hESC 转录组中普遍存在
作者通过 acRIP-seq 定位了 ac4C 修饰在野生型（WT）hESC 上的位置，观察到 ac4C 峰在编码序列（CDS）中富集，也有相当一部分会在 3』-UTRs 中富集。在具有 ac4C 修饰的 mRNA 中，我们观察到编码核心多能性调节因子 OCT4（POU5F1）、SOX2 和 NANOG 的 mRNA 始终被 ac4C 修饰，此外，还检测到其他与多能性相关的基因转录本具有 ac4C 修饰。
 
2、乙酰转移酶 NAT10 的表达与多能性呈正相关
为了了解 ac4C 修饰在多能性维持中的作用，作者重点研究了 NAT10，这是人类中 wei 一已知的 ac4C 乙酰转移酶，其表达水平直接影响 ac4C 在 RNA 上的形成。作者首先研究了 NAT10 在人类早期胚胎发育过程中的表达模式，发现 NAT10 在外胚层中高表达，但在三胚层发育过程中表达显著下调。随后通过 EB（胚状体）形成进行自发分化实验，发现在自发分化过程中，mRNA 和蛋白水平上 NAT10 的表达显著下降，与 OCT4 的表达趋势相似。定向分化检测显示在早期分化过程中 NAT10 和 OCT4 下调，分化标志物 SOX1 和 SOX17 在 mRNA 和蛋白水平上均上调。
3、NAT10 的扰动会损害 hESC 的自我更新，并促进 hESC 的早期分化
作者构建了 NAT10 KD hESCs(RNAi 敲低 NAT10）和 sh control hESCs（shRNA 慢病毒对照）两种类型细胞，在相同条件下培养后，KD 细胞比 sh 对照细胞表现出更少、更小的菌落，增值效率也显著降低。用 Western blot 和 RT-qPCR 方法检测多能性标记物和发育调控因子的基因表达，相比于 sh control hESCs，NAT10 KD hESCs 显示核心多能性调节因子 OCT4、NANOG、SOX2 的表达减少，而三胚层的发育调节因子表达增加。为了更全面地分析 NAT10 敲低导致的 hESCs 基因表达的改变，作者对 NAT10 KD 和 sh control 的 hESCs 进行了高通量 RNA 测序，结果显示，NAT10 基因的敲除导致 2455 个基因表达下调，1548 个基因表达上调。对 NAT10 KD hESCs 中下调的差异表达基因（DEGs）的 GO-BP 功能富集分析显示，部分基因在多细胞生物信号通路、第二信号通路介导的信号通路和多种信号通路中富集。对 NAT10 KD hESCs 中上调的 DEGs 进行分析，显示出与形态发生、发育和分化相关的显著功能，如肾脏形态发生、内胚层发育和内胚层细胞分化。综上所述，结果表明 NAT10 敲除的干扰损害了 hESCs 的自我更新，并促进了早期分化。
4、过表达 NAT10 可促进 hESC 的自我更新
作者生成过表达细胞系（NAT10 OE hESCs），以研究 NAT10 在 hESCs 中是否为自我更新的调节因子。实验结果显示，NAT10 OE hESCs 与对照组保持相同未分化形态，NAT10 OE hESCs 的增殖率明显高于对照 hESCs。对 NAT10 过表达组和对照组中核心多能标记物的 Western blot 检测结果发现，在 NAT10 OE hESCs 中 OCT4 和 SOX2 的表达显著增加，而 NANOG 的表达没有明显改变。这些数据显示 NAT10 的过表达有助于促进 hESCs 的自我更新。
5、NAT10 缺失导致靶基因上的 ac4C 缺失
研究在转录组规模上 NAT10 缺失对 ac4C 修饰的影响，作者对 NAT10 KD hESCs 进行了 acRIP-seq 实验，比较 NAT10 KD hESCs 与 WT hESCs 的 ac4C 峰和靶基因，在 NAT10 KD hESCs 中，ac4C 乙酰化峰得分总体降低。作者又进行了基于 NaCNBH3 的化学 ac4C 测序，以消除假阳性，两种方法联合分析鉴定出 476 个 NAT10 应答的 ac4C 靶基因，热图还显示，在 NAT10 KD 的 hESCs 中，这些 NAT10 应答的 ac4C 靶基因的乙酰化水平显著降低。这些靶基因的 GO-BP 功能富集分析突出了几个功能组，如有丝分裂核分裂、DNA 复制、细胞周期正调控、mRNA 稳定性调控、干细胞群体维持和内胚层发育等，并且在这 476 个对 NAT10 应答的 ac4C 靶基因中，观察到了两个核心多能性调控因子，即 OCT4 和 SOX2。

通过 LC-MS/MS 评估了 WT 和 NAT10 KD hESCs 的总 RNA 和 mRNA 中 ac4C 修饰水平。发现在 hESCs 中，mRNA 上存在大量的 ac4C 修饰，与 WT hESCs 相比，NAT10 KD hESCs 的 ac4C 丰度在总 RNA 和 mRNA 中都显著降低。这些结果表明，NAT10 催化的 ac4C 乙酰化主要分布在 mRNA 上，这可能与 hESC 的细胞周期、mRNA 稳定性和自我更新有关。
6、排除 tRNA 和 rRNA 的 ac4C 修饰对 hESC 自我更新的影响
tRNA ac4C 乙酰化也依赖于关键蛋白辅助因子 THUMPD1。为了进一步研究排除 tRNA ac4C 乙酰化对 hESCs 自我更新的重要贡献，作者通过 CRISPR/Cas9 靶向 THUMPD1 位点，构建了 THUMPD1 敲除（KO）的 hESCs。形态学图像显示，THUMPD1 KO hESCs 与对照组 hESCs 之间的细胞形态没有显著差异，并且两种 hESCs 形成的菌落数量也没有明显差异，说明 THUMPD1 敲除对 hESCs 的增殖率没有显著影响。通过 Western blot 检测 THUMPD1 KO hESCs 和对照组中 OCT4、SOX2 和 NANOG 的蛋白水平，与对照组 hESCs 相比，THUMPD1 KO hESCs 中 OCT4 和 NANOG 的表达没有明显变化。同样，SNORD13 是 rRNA 乙酰化所特别需要的，作者利用 CRISPR/Cas9 构建了 SNORD13 敲除（KO）的 hESCs，与前面所述结果相似，与对照组相比，SNORD13 KO hESCs 的细胞形态、菌落数量无显著差异，OCT4、SOX2 和 NANOG 的表达也没有明显差异。上述结果说明 rRNA 和 tRNA ac4C 乙酰化对 hESCs 的自我更新没有产生显著影响。
7、NAT10 催化 ac4C 修饰靶向核心多能性因子 OCT4，调控其 mRNA 的稳定性
为了进一步验证 OCT4 和 SOX2 的 ac4C 丰度，作者进行了 acRIP-qPCR 检测，并以 IgG 作为同型对照。结果显示，NAT10 KD 细胞中 OCT4 的 ac4C 丰度明显降低，而与 Sh 对照组相比，SOX2 没有明显变化，这表明 SOX2 对 NAT10 应答的 ac4C 靶基因的置信度较低。对 NAT10 KD 和 sh 对照的 hESCs 的 mRNA 半衰期分析得出，NAT10 的扰动可能导致 mRNA 稳定性的整体显著下降，与 sh 对照相比，NAT10 KD 中 OCT4 的半衰期下降最显著，SOX2 没有显著下降。NAT10 敲除后，OCT4 mRNA 的稳定性显著降低，而 SOX2 mRNA 的稳定性没有显著变化。综上所述，这些结果表明核心多能性相关基因 OCT4 是 NAT10 介导的 ac4C 修饰的显著功能靶点，且 NAT10 维持了 OCT4 的 mRNA 稳定性和蛋白表达水平。
01 ac4C RNA 修饰测序
ac4C RNA 修饰测序
对 ac4C RNA 乙酰化，目前流行的检测手段为 acRIP-seq 技术，适用于 ac4C RNA 乙酰化谱研究，快速筛选 ac4C RNA 乙酰化靶基因。云序可提供 mRNA 和多种非编码 RNA 的 ac4C 测序：
ac4C 全转录组测序（涵盖 mRNA，LncRNA，circRNA）
ac4C  LncRNA 测序（涵盖 LncRNA 和 mRNA）
ac4C  Pri-miRNA 测序（涵盖 Pri-miRNA 和 mRNA）
ac4C  mRNA 测序
ac4C  rRNA 测序
ac4C  circRNA 测序
ac4C  tRNA 测序

02 检测整体 ac4C RNA 修饰水平
LC-MS/MS 检测整体RNA修饰水平
精准高效，可以实现一次检测，9 类修饰水平检测，一步到位。
03 ac4C RNA 修饰上游酶的筛选
ac4C RNA 修饰相关酶 PCR 芯片
寻找上游直接调控ac4C RNA乙酰化的甲基转移酶。
04 ac4C RNA 修饰靶基因验证
acRIP-qPCR
云序提供 acRIP-qPCR 服务，可针对 mRNA，lncRNA，环状RNA 等不同类型的 RNA 分子进行检测，低通量验证靶基因 RNA 修饰水平。
05 机制互作研究
RIP-seq/qPCR
筛选或验证 RNA 修饰直接靶点，研究 RNA 修饰靶基因的调控机制。
RNA pull down -MS/WB
筛选或验证目标 RNA 互作基因或蛋白，研究相应的分子调控机制。
06 翻译组
Ribo-seq（核糖体印记测序）
检测转录本上核糖体的分布和翻译活性，了解蛋白质表达情况以及翻译过程。
  优势一：云序累计支持客户发表百余篇 RNA 修饰 SCI 论文，合计影响因子 1000+, 其中 RNA 乙酰化测序有多达 5 篇影响因子接近 20 分的高分论文。
优势二：累计完成数千例 RNA 甲基化测序样本，全面覆盖医口、农口等各类样本。
优势三：全面检测 mRNA 和各类非编码 RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA 等）。
优势四：提供 ac4C 一站式服务：ac4C 整体水平检测、acRIP-seq、acRIP-qPCR 验证、RIP 和 RNA pull down 等。
优势五：率先研发超微量 acRIP 测序技术，RNA 量低至 500ng 起。
优势六：国内较全的 RNA 修饰测序平台，提供 m6A、m5C、m1A、m7 G、m3C、m6Am、O8 G、ac4C 乙酰化和 2'-O-甲基化测序。

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