m6A（N6-methyladenosine）修饰是真核生物最常见的mRNA转录后修饰，在病毒感染中起着至关重要的作用。而由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起的新城疫病(Newcastle disease, ND)作为一种高度传染性的禽类病毒性疾病，m6A修饰在NDV感染反应中的功能或特征尚不清楚。
云序客户吉林大学丁壮教授科研团队通过云序生物提供的m6A MeRIP-seq，RNA-seq等技术首次探究NDV感染的鸡巨噬细胞中的m6A表达谱，该研究成果以“Transcriptome-wide N6-methyladenosine modification profiling of mRNAs during infection of Newcastle disease virus in chicken macrophages”为题发表在《Virus Research》杂志上。
论文题目：Transcriptome-wide N6-methyladenosine modification profiling of mRNAs during infection of Newcastle disease virus in chicken macrophages
发表期刊：Virus Research
影响因子：6.286/Q2
发表时间：2022年10月27日 
期刊ISSN：0168-1702
研究方法：m6A MeRIP-seq，RNA-seq等
 

1、m6A修饰的转录组图谱
研究人员以NDV毒株NA-1感染的鸡巨噬细胞系HD11细胞为样本，通过m6A MeRIP-seq（云序生物提供），发现m6A修饰主要分布在CDS区域，其次是终止密码子和起始密码子，3'UTRs和5'UTRs中较少。而且NDV感染后，CDS和起始密码子中m6A修饰位点的变化更为明显。通过分析m6A峰在转录组中的分布模式，发现m6A峰主要富集在CDS区域，在3 '端(终止密码子附近)有一个独特的富集。然后进一步探究m6A峰附近区域的motifs，发现在对照HD11细胞中，m6a修饰结合的motif GGACU最多；而NDV感染的HD11细胞中显著富集的motif是GADGARGA (D=“AGU”，R=“AG”)，与传统的DRACH/ RRACH保守motif不同。 2、差异RNA甲基化位点鉴定
为了确定感染组和对照组之间m6A修饰的差异，研究人员共筛选到分布在4584个基因上的9496个m6A差异峰，其中分布在3320个基因中的7015个峰显著上调，分布在1264个基因中的2481个峰显著下调。所有m6A峰的平均长度为342.75 bp，所有峰的平均对数富集倍数为1.93。通过总RNA甲基化分析，发现与对照组相比，NDV感染后HD11细胞的RNA甲基化程度显著增加。为了探讨影响mRNA甲基化状态变化的因素，进一步探究甲基转移酶、去甲基转移酶和RNA结合蛋白的表达水平，结果显示，NDV感染后，METTL14、FTO、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3表达显著上调，METTL3表达下调，而ALKBH5表达无显著差异。 3、GO和KEGG通路富集分析
为了进一步探索m6A修饰在NDV感染中的作用，对差异m6A甲基化修饰基因进行GO和KEGG通路分析。KEGG分析显示，m6A修饰度高的基因主要参与细胞代谢调节，包括N-聚糖生物合成、糖胺聚糖生物合成-硫酸软骨素/硫酸皮肤素、磷脂酰肌醇信号系统，而m6A修饰度低的基因主要参与先天免疫相关通路，包括RIG-Ｉ样受体信号通路、NOD样受体信号通路、MAPK信号通路、和Toll样受体信号通路。  
4、NDV感染后细胞的mRNA表达谱
为了进一步探讨m6A修饰对基因表达的影响，根据RNA-seq数据，鉴定NDV感染和对照HD11细胞的差异表达基因，发现550个基因表达上调，1106个基因表达下调。热图显示感染组和对照组之间的表达水平存在显著差异，而同组的三个重复样本之间的表达水平表现出相似性。火山图显示NDV感染组和对照组之间差异表达的mRNA。  
5、联合分析NDV感染后差异m6A修饰基因与差异表达mRNA
为了探索m6A修饰的基因与差异表达mRNA之间的关系，对差异m6A甲基化修饰基因(倍数变化≥2, p < 0.0001)与差异表达mRNA(倍数变化≥2, p < 0.05)进行联合分析。发现共有1234个基因在甲基化水平和表达水平上都发生显著改变，其中8个基因在甲基化和表达水平上出现上调，20个基因在甲基化和表达水平上出现下调，1206个基因的m6A修饰水平与基因表达呈负相关。接着，分别对830个甲基化水平上调、表达水平下调的基因和376个甲基化水平下调、表达水平上调的基因进行KEEG和GO富集分析。甲基化水平上调和表达水平下调的基因主要富集于抗病毒相关信号通路，如Toll样受体信号通路、细胞因子-细胞因子受体互作，RIG-I类受体信号通路；GO分析显示该类基因主要富集在RNA模板，核小体和分子功能调节剂等。甲基化水平下调和表达水平上调的基因主要参与类固醇生物合成、N -聚糖生物合成和脂肪酸代谢，表明在新城疫感染期间，这些基因主要调节细胞代谢。进一步构建前10个最富集的KEEG信号通路及其相关的差异m6A修饰基因和差异表达基因之间的调控网络。

  01 m6A RNA修饰测序
m6A RNA修饰测序（m6A-meRIP-seq）
对m6A RNA甲基化，目前流行的检测手段为m6A-MeRIP-Seq技术，适用于m6A RNA甲基化谱研究，快速筛选m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多种非编码RNA的m6A测序：

• m6A 全转录组测序（涵盖mRNA，LncRNA，circRNA）
• m6A  LncRNA测序（涵盖LncRNA和mRNA）
• m6A  Pri-miRNA测序（涵盖Pri-miRNA和mRNA）
• m6A  mRNA测序
• m6A  miRNA测序

02 检测整体m6A RNA修饰水平
LC-MS/MS检测整体RNA修饰水平
精准高效，可以实现一次检测，9类修饰水平检测，一步到位。
比色法检测整体RNA修饰水平
快速检测m6A整体甲基化水平
03 m6A RNA修饰上游酶的筛选
m6A RNA修饰相关酶PCR芯片
寻找上游直接调控m6A RNA甲基化的甲基转移酶。
04 m6A RNA修饰靶基因验证
MeRIP-qPCR/GenSeq® MeRIP试剂盒
云序提供各类不同修饰的meRIP-qPCR服务以及销售GenSeq® MeRIP试剂盒，可针对mRNA，lncRNA，环状RNA等不同类型的RNA分子进行检测，低通量验证RNA修饰靶基因表达水平。
05 机制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR/GenSeq® RIP试剂盒
筛选或验证RNA修饰直接靶点，研究RNA修饰靶基因的调控机制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
筛选或验证目标RNA互作基因或蛋白，研究相应的分子调控机制。
5.3 ChIP-seq
筛选或验证目标蛋白与DNA互作，研究相应的分子调控机制。
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m6A RNA甲基化测序

m5C RNA甲基化测序

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ac4C RNA乙酰化测序

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m6Am RNA甲基化测序

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RNA-seq

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