成熟是果实美味的最后一个不可逆的发育阶段，能促进果实传播，但是果实成熟的调控机制还未完全阐明。2022年8月25日，云序客户北京农林科学院左进华课题组在the plant journal杂志上发表了文章“DNA and coding/non-coding RNA methylation analysis provide insights into tomato fruit ripening”。该研究通过对不同成熟阶段的番茄果实甲基化程度进行比较，在转录和表观遗传水平上探讨了肉质果实成熟过程中的调控关系，并构建了协调调控网络模型。云序生物有幸参与了此项研究中的m5C merip seq、5mC medip seq、全转录组测序等高通量技术服务。

发表期刊：the plant journal
影响因子：7.091
发表时间：2022年8月25日
研究方法：m5C merip seq、5mC medip seq、全转录组测序
文章链接：DNA and coding/non-coding RNA methylation analysis provide insights into tomato fruit ripening

 

云序生物提供的服务：

技术路线

1.Alisa Craig（AC）番茄果实成熟过程中的多组学特征分析
全转录组测序结果发现番茄果实中有2851个基因存在差异表达。其中1148个基因表达上调，1703个基因表达下调。由于DNA甲基化状态是番茄果实成熟调控的一个指标，随后，作者利用5mC medip seq检测了在发育过程中与番茄成熟基因相关的DNA（5mC）甲基化的变化，KEGG通路分析显示，与苯丙氨酸代谢、脂肪酸代谢、苯丙素生物合成和植物激素信号转导相关的基因被富集（图1a），GO富集分析发现，所有的差异甲基化基因都在脂质代谢过程中富集，并且在启动子、上游区域、内含子、外显子和基因间区域中都能检测到内部5mC甲基化峰，启动子上的5mC峰最多。(图1b）。结果表明，5mC在番茄基因组的所有染色体上广泛分布，低甲基化区域多于高甲基化区域，果实成熟过程中DNA（5mC）甲基化呈整体减少趋势（图1c）。此外，差异甲基化区域（DMRs）和差异表达基因（DEGs）数据的整合揭示了参与植物激素生物合成和信号转导的基因，如生长素响应蛋白IAA17（IAA17）、aba响应元件结合因子（AREB1）、生长素响应蛋白SAUR50（SAUR50）和gibbberrellin2-双加氧酶3。
为了确定m5C峰在番茄中的分布，作者比较了AC-MG和ACBr + 6期的DMRs。m5C merip seq发现番茄中存在m5C峰富集的序列基序，如UGUAC和UUCU，此外，还发现了另外两个基序GUGGRG和UAUAUG（图2a-d）。

图1.绿熟期（MG）和红熟6期（Br + 6）AC番茄DNA上的5mC甲基化检测

2、番茄果实成熟过程中的多组学特征分析
对绿熟期与黄熟期Nr果实的全转录组测序分析发现，共有2247个差异表达基因（DEGs），其中858个表达上调，1389个表达下调（图3a)。并且在Nr果实成熟过程中鉴定出了31个环状RNA和32个lncRNA的差异表达情况。此外，作者还进行了DNA（5mC）甲基化分析，以深入探究了Nr突变体果实在不同阶段的（5mC）水平。在基因组水平上，DMRs在每个染色体上的分布并不均匀；1号染色体甲基化区域最多，6号染色体甲基化区域最少（图3b)，在12条染色体上，共鉴定出1694个上调的DMRs和4190个下调的DMRs（图3c）。研究结果表明，RNA甲基化（m5C）能功能调控基因的表达，但是m5C与mRNA丰度之间的相关性仍有待进一步探索（图3d)。此后，为了验证m5C丰度的差异，作者选择了参与果实成熟的基因，并验证了WRKY TFs和MADS-box蛋白EJ2中m5C的丰度变化（图3e-f）。
3、AC和Nr果实绿熟期的多组学概况分析
对AC和Nr果实成熟绿色期的DEG进行比较分析，共发现1981个差异表达基因，其中977个表达上调，1004个表达下调（图4a-b)。在AC和Nr突变体果实之间共鉴定出100个DMRs，其中许多都参与了果实的成熟过程，并且发现5mC在基因间和上游DNA区域周围高度富集（图4c)。此外，KEGG分析表明，甲基化基因富集于萜类主干生物合成、淀粉和蔗糖代谢以及戊糖和葡萄糖醛酸盐的相互转化的通路上（图4d），随后，作者研究了Nr果实成熟过程中与基因表达相关的yi烯释放过程中DNA甲基化（5mC）的变化，发现EBF1和ERF6被高甲基化，同时Nr-G和AC-MG的表达表达下调（图4e）。一些DMRs和DEGs，如a-Man、PG、CESA2、PEI、PE和XTH23也被发现参与了果实的质地调控(图4f）。
4、AC与Nr果实成熟期的多组学谱分析
作者比较了Nr-O和AC-Br + 6果实之间的DEGs，发现了2261个DEGs，其中1190个表达上调，1071个表达下调(图5a）。共发现21个差异表达（DE)的 lncRNA和33个DE环状RNA，其中有11个lncRNA和16个环状RNA显著上调，而10个lncRNA和17个环状RNA被下调(图5a）。DMRs的GO和KEGG通路分析显示，Nr-O和Nr-G中存在许多与油菜素内酯生物合成、倍半萜生物合成、三萜生物合成、二萜生物合成和类胡萝卜素生物合成相关的基因。根据MeDIP-seq的结果，这些序列的长度在1000~10000bp之间（图5b），此外，作者还发现了许多编码转录因子的基因，如bHLH18/74/90/123、MYB13/20/21/36/41S3和WRKY49/72/ 77（图5c）。
5.AC和Nr突变体果实成熟过程的多组学比较分析
为了确定AC果实和Nr突变体果实成熟过程之间的差异，作者比较了AC-MG与AC- Br + 6和Nr-MG与Nr-O之间的DEGs，共发现63个DEGs，其中14个表达上调，49个表达下调（图6a)。相比之下，仅Nr突变体的果实中就有86个与成熟相关的基因差异表达，其中33个基因表达上调，53个基因表达下调（图6b）。随后，通过比较AC和Nr果实中与细胞壁代谢相关的基因，作者发现这些基因在Nr中的表达倍数变化大于AC果实。并且yi烯合成和信号转导相关基因的表达量Nr果实大于AC果实。为了进一步探究果实间的成熟过程差异，作者还分析了Nr-O、Nr-G、ACBr + 6和AC-MG组的环状RNA、lncRNAs及其相应的靶基因。在AC和Nr果实中发现11个lncRNA和10个环状RNA为差异表达，其中3个lncRNA上调，8个lncRNA下调，6个环状RNA上调，4个环状RNA下调，并且在Nr中特异性鉴定出19个lncRNA和22个环状RNA(图6f-g）。通过DMRs和DEGs联合分析结果的维恩图，显示了AC-MG和AC-Br + 6与Nr-MG和Nr-O对照组中常见和特异性的甲基化基因，并发现在Nr突变体中表达的特定基因中，96个DEGs表达降低，39个表达增加（图6h）。 该篇文章联合m5C merip seq和5mC medip seq技术，在转录和表观遗传水平上探讨了肉质果实成熟过程中的调控关系，并构建了协调调控网络模型（图7），发现AC和Nr中的DMRs和DEGs协同作用与yi烯释放、类胡萝卜素积累和细胞壁代谢有关，从而调节果实成熟。首次揭示了mRNA和ncRNA m5C的表达谱，为今后研究果实的成熟和衰老提供了参考数据。

图7.果实成熟过程中yi烯反应和类胡萝卜素积累、细胞壁分裂和芳香化合物相关途径的调控模型。

 

云序生物m5C甲基化研究五大模块

 

01 m5C RNA甲基化测序

m5C RNA甲基化测序（m5C-seq）

对m5C RNA甲基化，目前流行的检测手段为m5C-Seq技术，适用于m5C RNA甲基化谱研究，快速筛选m5C RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多种非编码RNA的m5C测序：

• m5C 全转录组测序（涵盖mRNA，LncRNA，circRNA）
• m5C  LncRNA测序（涵盖LncRNA和mRNA）
• m5C  Pri-miRNA测序（涵盖Pri-miRNA和mRNA）
• m5C  mRNA测序

02 检测整体m5C RNA甲基化水平

LC-MS/MS检测整体RNA甲基化水平

精准高效，可以实现一次检测，9类修饰水平检测，一步到位。

03 m5C RNA甲基化上游酶的筛选

m5C RNA甲基化相关酶PCR芯片

寻找上游直接调控m5C RNA甲基化的甲基转移酶。

04 m5C RNA甲基化靶基因验证

meRIP-qPCR

云序提供各类不同修饰的meRIP-qPCR服务，可针对mRNA，lncRNA，环状RNA等不同类型的RNA分子进行检测，低通量验证RNA修饰靶基因表达水平。

05 机制互作研究

5.1 RIP-seq/qPCR

筛选或验证RNA修饰直接靶点，研究RNA修饰靶基因的调控机制。

5.2 RNA pull down -MS/WB

筛选或验证目标RNA互作基因或蛋白，研究相应的分子调控机制。

5.3 双荧光素酶实验

验证两基因互作，研究相应的分子调控机制。

5.4 ChIP-seq

筛选或验证目标蛋白与DNA互作，研究相应的分子调控机制。

  DNA甲基化：DNA甲基化能控制基因表达，因而在动植物的生长发育过程中发挥着关键的调控作用，并且与包括癌症在内的多种人类疾病密切相关，是表观遗传学研究的热点。
01 MeDIP甲基化测序
将甲基化DNA免疫共沉淀技术（MeDIP）和高通量测序相结合，能够帮助客户快速地获取全基因组范围内的DNA甲基化图谱，并比较不同样品中的甲基化分布差异。配合强大的生信分析实力，我们提供的不仅是海量的测序数据，而且是根据您的研究目的，有针对性地挖掘提炼出取之即可用的结果及出版级图片。
MeDIP优势：
1.1 相比于WGBS全基因组检测，性价比更高！
1.2实现对甲基化（5mC）和羟甲基化（5hmC）的区分。

02  ctDNA EM-seq甲基化测序
针对体液样品中的 ctDNA 进行优化，云序生物为您带来一种基于酶学方法的 DNA甲基化测序技术 EM-seq（Enzymatic Methyl-seq）。该方法结合使用多种酶，在保证 5mC 和 5hmC 在 Illumina 测序中仍被识别为 C 的前提条件下，将未发生修饰的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），并在后续的扩增和测序过程中被识别为胸腺嘧啶（T）。EM-seq 有效弥补了全基因组重亚硫酸盐法测序（WGBS）需要极端反应条件的缺陷，可以广泛应用于包含 ctDNA 在内的微量脆弱 DNA 样品。运用 EM-seq 技术，仅需低至 10 ng 的 DNA 样品便可进行单碱基精度的全基因组 5mC 修饰测序。

EM-seq 的优势相比于传统的WGBS 拥有多种优势：
2.1 DNA 测序文库质量高、所需 DNA 起始量小
相比于WGBS，EM-seq 对 DNA 的损伤小，因此可以用更少 DNA 样品、更少的 PCR 轮数扩增出高质量的测序文库。云序生物提供的 EM-seq 服务，所需的 DNA 起始量可低至10ng。
2.2 DNA 文库的插入片段更长、更完整
相比于WGBS，EM-seq 处理后的 DNA 片段更完整，长度更长，避免产生测序缺口。
2.3 出色的 GC 覆盖均一性
无论 GC 程度高低，EM-seq 的覆盖度都有均匀且优良的表现；相比之下，WGBS 测序文库高估了 AT 区，却低估了 GC 区，造成“GC 覆盖度偏误”。
2.4 均一的双核苷酸分布
由于“GC 覆盖度偏误”的存在，在连续双核苷酸的检出效率方面，WGBS 对于不同的双核苷酸存在较严重的偏误，而 EM-seq 则能展示出均一的覆盖情况。
2.5 更强的匹配率和更低的重复率
相比于 WGBS，EM-seq 测序结果与参考基因组的匹配率更高，同时重复率更低。
2.6 用更少的测序检出更多的 CpG 岛
同等测序覆盖深度的情形下，EM-seq 所发现的 CpG 数目要远多于 WGBS，在这其中有很大比例的 CpG 位点是仅仅只能能用 EM-seq 法才能检测到的。
  优势一：云序累计支持客户发表 87 +篇RNA修饰及DNA修饰SCI论文，合计影响因子 810  +
优势二：累计完成数千例 RNA及DNA甲基化测序样本，全面覆盖医口、农口等各类样本。
优势三：全面检测mRNA和各类非编码RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。
优势四：提供m5C一站式服务：m5C整体水平检测、m5C-seq、MeRIP-qPCR验证、RIP和RNA pull-down等。
优势五：超微量MeRIP测序技术，RNA量低至500ng起。
优势六：全面提供多种 RNA 修饰测序服务，包含m6A、m6Am、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙酰化和2'-O-甲基化测序。
优势七：全面提供多种DNA修饰测序服务，包括5mC、5hmC、6mA等甲基化测序。
 

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