非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是由肝脏脂质代谢失衡引起的，但发病机制尚未完成阐明。2022年9月1日，云序客户的研究者们在Nature Metabolism（IF=19.865）杂志上发表了文章“Orosomucoid 2 maintains hepatic lipid homeostasis through suppression of de novo lipogenesis”。该研究通过多种小鼠模型，首次揭示了肝脏分泌因子Orosomucoid 2 （ORM2）通过特异性抑制脂质从头合成途径（DNL），维持肝脏和全身脂质稳态的作用。此项研究结果表明，肝脏ORM2信号通路是脂质代谢重要调节因子，为NAFLD、NASH和高脂血症提供了一个潜在的干预靶点。云序生物有幸参与了此项研究中的RNA-seq、磷酸化蛋白质谱、CoIP-质谱法等高通量技术服务。

发表期刊：Nature Metabolism
影响因子：19.865
发表时间：2022年9月1日
研究方法：RNA-seq、磷酸化蛋白质谱、CoIP-质谱法

文章链接：Orosomucoid 2 maintains hepatic lipid homeostasis through suppression of de novo lipogenesis

 

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技术路线

1. ORM2在NAFLD小鼠中下调
为了探究ORM2是否参与肝脏脂质调节，作者使用了三种类型的NAFLD小鼠模型（瘦素受体缺陷的db/db、瘦素缺陷的ob/ob、高脂饮食喂养的HFD）检测了其在肝脏和血浆中的表达。结果显示，与对照组相比，NAFLD小鼠的肝脏和血浆中ORM2蛋白水平均显著降低（图1a-f）。
2. ORM2缺失促进小鼠肝脏脂质积累
ORM2在NAFLD中表达下调提示其可能参与了肝脏TG代谢的调控。因此，作者构建了ORM2基因野生型（WT）、杂合子（HE）和敲除（KO）小鼠（图2a-b）用于后续研究。与WT小鼠相比，KO小鼠肝脏中ORM2的mRNA表达水平极低，而ORM1和ORM3的mRNA水平均不受ORM2缺失的显著影响，证实了KO小鼠肝脏中ORM2的缺失，且没有ORM1和ORM3的代偿性上调（图2c）。值得注意的是，在正常饲料（ND）喂养下，与WT小鼠相比，KO小鼠的肝脏与体重比、肝脏和血浆TG水平显著升高（图2d-g）。同时，与野生型雌性小鼠相比，ORM2缺陷的雌性小鼠的肝脏和血浆TG水平升高（图2h-l）。因此，ORM2可能在肝脏TG稳态的生理维持中发挥不可或缺的作用，且ORM2在肝脏和全身TG稳态中的保护作用可能与性别无关。
3. ORM2缺乏会加剧饮食引起的肝脂肪变性
作者用HFD喂养小鼠8周，以诱导单纯性脂肪变性后，发现与野生型小鼠相比，KO小鼠发生了更严重的肝脂肪变性，肝体重比更高，肝脏和血浆TG水平升高（图3a-c），脂质积累加重（图3b-d）。接下来，作者用HFHC饮食喂养小鼠24周，以诱导NASH发病机制。与WT小鼠相比，HE和KO雄性小鼠的肝重比更大，肝脏和血浆TG含量更高（图3e-g）。ORM2缺陷小鼠的血浆ALT和AST水平显著升高（图3h-i），同时表现出F4/80阳性巨噬细胞丰度增加和更严重的肝纤维化（图3j-l）。在HE和KO小鼠的肝脏中，参与肝脏炎症和纤维化的基因的表达水平一致上调（图3m）。以上数据表明，ORM2缺乏加剧了饮食诱导的脂肪变性和脂肪性肝炎。
4. ORM2过表达可减轻肝脂肪变性和高脂血症
为了探究肝脏特异性过表达ORM2是否可以降低肝脏TG水平，改善脂肪变性，作者通过尾静脉注射腺病毒（Ad），以构建肝脏ORM2过表达ob/ob小鼠（图4a-c），以及Ad-GFP阴性对照小鼠。结果表明，Ad-ORM2处理对体重和食物摄入量没有影响（图4d-e），但Ad-ORM2小鼠的肝脏体重比、肝脏和血浆TG含量显著低于表达Ad-GFP的小鼠（图4f-h）。在ORM2过表达的小鼠中，脂滴较小，含量较少（图4i），血浆总胆固醇（TC）和LDL-C水平较低（图4j-k)。总之，ORM2表达恢复可以改善肥胖相关的肝脂肪变性和血脂异常。为了进一步确定ORM2的保护作用，作者使用肝特异性甲状腺激素驱动的腺相关病毒（AAV）9型AAV-GFP或AAV-ORM2，尾静脉注射C57BL/6J雄性小鼠后，将小鼠ND或HFD喂养12周，分别命名为ND/AAV-GFP、HFD/AAV-GFP和HFD/AAV-ORM2。与ND/AAV-GFP小鼠相比，HFD/AAV-GFP和HFD/AAV-ORM2小鼠的体重逐渐增加，但后两组间小鼠的体重没有明显区别（图4l）。WB结果显示，与ND/AAV-GFP小鼠相比，HFD/AAV-GFP小鼠肝脏中ORM2蛋白水平降低（图4n），但在HFD/AAV-ORM2小鼠肝脏中表达恢复（图4n)。与ND/AAV-GFP小鼠相比，HFD/AAV-GFP小鼠的肝/体重比、肝和血浆TG含量、脂滴积累以及血浆TC和LDL-C水平显著升高（图4o-t）。值得注意的是，AAV-ORM2治疗显著缓解了HFD相关的脂质代谢恶化（图4o-t）。因此，这些发现表明AAV介导的ORM2表达可以防止HFD诱导的肝脂肪变性和血脂异常的发生。
5. ORM2抑制脂肪生成基因的表达
为了探究ORM2维持肝脏脂质稳态的下游靶点，作者对Ad-ORM2和Ad-GFP转导的ob/ob小鼠的肝脏进行了RNA-seq测序分析，结果显示Ad-ORM2处理抑制了大多数基因（图5a）。以P值<0.05和fold change >2.0为差异阈值，作者发现表达Ad-ORM2的ob/ob小鼠肝脏中有90个基因（28.75%）表达上调，223个基因表达下调（71.25%）（图5b）。GO分析表明，下调的基因在脂肪酸代谢过程中高度富集（图5c）。RT-qPCR证实，表达Ad-ORM2的ob/ob小鼠中SREBP-1c及其下游基因（Fasn、Scd1和Acc1）的mRNA表达水平显著降低（图5d）。通过对肝提取物进行免疫印迹证实，在蛋白水平上也出现了脂肪生成基因的下调（图5e）。Ad-ORM2转导也导致db/db小鼠（图5f、g）和HFD小鼠（图5h、i）肝脏中脂肪生成基因的表达显著降低。此外，与HFD/AAV-GFP小鼠相比，HFD/AAV-ORM2小鼠的脂肪生成基因表达减少，达到了与ND/AAV-GFP小鼠相似的水平（图5j，k）。与WT小鼠相比，在ND或HFD喂养条件下，ORM2 HE和KO小鼠的肝脏中均脂肪生成基因表达上调（图5l-o）。这些发现表明，ORM2可能通过下调与DNL相关的基因表达来维持肝脂质稳态。
6. ORM2激活ca2+-CaMKK2-AMPK信号通路抑制DNL
为了探究对ORM2应答的细胞内信号通路，作者使用来自Ad-ORM2或Ad-GFP转导的ob/ob小鼠的肝脏进行了磷酸化蛋白质谱分析。基于差异磷酸化肽及其KEGG通路的富集，作者发现AMPK信号通路被高度激活（图6a-b）。WB证实，与表达Ad-GFP的ob/ob小鼠相比，表达Ad-orm2的ob/ob小鼠肝脏中AMPK及其靶点ACC的磷酸化水平显著增强（图6c）。在ORM2过表达的小鼠中，mTOR信号，包括mTOR和P70S6K的磷酸化被抑制（图6c）；而AKT和STAT3的磷酸化状态在Ad-ORM2处理后没有改变（图6c）。同样，在过表达ORM2的db/db小鼠的肝脏中，可以观察到AMPK信号通路的激活和mTOR信号通路的抑制（图6d）。接下来，作者进行了体外研究来检测ORM2对肝细胞的直接作用。结果发现，内源性ORM2的敲除显著增加了HPHs中细胞TG的积累，并上调了脂肪生成基因的表达（图6e-g）。相反，ORM2重组蛋白处理显著降低了HPHs中细胞TG含量，下调了脂肪生成基因（图6h-i）。同时，无论是ORM2敲低还是处理，参与脂肪酸氧化和脂质转运的基因的表达水平均不受影响（图6g-i）。此外，肝脏特异性Prkaa1和Prkaa2双敲除（DKO）雄性小鼠（Prkaa DKO）的MPHs显示，ORM2介导的对细胞TG积累和脂肪生成基因表达的抑制显著消失（图6j-l）。因此，AMPK激活是ORM2必要的下游信号效应器。此外，Prkaa WT肝细胞显著降低了DNL率（图6n)；然而，Prkaa DKO细胞中这种作用减弱（图6o）。同时，重新引入ORM2显著抑制了ORM2 KO肝细胞中的DNL率（图6p），OTO-609明显消除了ORM2对DNL率的抑制（图6q）。总之，这些发现证明了ORM2在抑制DNL中的直接作用，而DNL依赖于CaMKK2和AMPK。
7. ORM2与ITPR2相互作用的鉴定
为了鉴定负责ORM2抑制脂肪生成作用的肝脏受体，作者将HA标记的ORM2表达质粒或EV转染到HEK 293T细胞中，HA-ORM2转染显著增强了AMPK的磷酸化（图7a）。然后，作者通过CoIP-质谱法鉴定与ORM2相互作用的蛋白，筛选到了120多种蛋白质。其中，ITPR2和ITPR3已被证实可介导哺乳动物细胞内Ca2+信号网络。因为ITPR3在正常肝脏中缺失，而ITPR2高表达，可定位于肝细胞的质膜（图7b），所以用于后续研究。ORM2和ITPR2之间的物理相互作用也通过免疫共沉淀和接近连接实验（PLA）得到证实（图7c-e）。为了确定ITPR2与ORM2互作位置，作者使用了ITPR2的几种截断形式，分析显示，ITPR2与ORM2相互作用需要结构域（氨基酸226-576）（Fig.7f-g）。然后，为了探究ITPR2的阻断是否会影响ORM2在体内的抗脂作用，作者通过尾静脉注射ob/ob雄性小鼠，给予靶向ITPR2的shRNA或阴性对照，然后用ORM2重组蛋白或载体对照处理。结果发现，注射shRNA ITPR2显著降低了ITPR2在肝脏中的表达（图7h）。虽然四组之间的体重和食物摄入量具有可比性（图7i-j），但ITPR2的下调显著阻断了ORM2对肝脏脂肪变性、高脂血症和脂肪生成基因表达水平的保护作用（图7k-q）。综上所述，ORM2通过涉及Ca2+、CaMKK2和AMPK的ITPR2依赖的信号级联来抑制肝脏脂肪生成。
8. 重组ORM2可改善小鼠肝脏脂肪变性和NASH
ORM2蛋白处理后，ob/ob小鼠肝体重比、肝脏和血浆TG含量、肝脂质积累呈剂量依赖性下降（图8a-d）。与此同时，ob/ob小鼠中脂肪生成基因和促炎基因的表达水平降低，AMPK信号通路被显著激活，而mTOR和P70S6K的磷酸化水平逐渐降低（图8e-g）。ORM2显著逆转了HFHC饲粮诱导的肝体重比和肝TG含量的升高，与此相一致，ORM2处理后降低了血浆ALT和AST水平（图8h-k）。组织学分析显示，饮食诱导的肝脂质积累、炎症和肝纤维化明显减轻(图8l-o）。肝脏的益处伴随着肝脏炎症和纤维化相关基因的表达减少（图8p）。综上所述，重组ORM2蛋白具有治疗NAFLD和NASH的潜力。 此项研究采用了RNA-seq、磷酸化蛋白质谱、CoIP-质谱法多组学高通量技术，确定了ORM2在抑制肝脏脂质合成和减轻肝脏脂质沉积方面的作用，发现了ORM2激活Ca2+-CaMKK2-AMPK信号通路抑制DNL。该文章为理解肝脏脂质稳态的调节机制提供了一个新的见解。此外，ORM2可能是治疗NAFLD、NASH、动脉粥样硬化和高脂血症的潜在干预靶点。
 

 

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