高级别浆液性卵巢癌 (HGSOC) 是卵巢癌最具侵袭性的亚型，HGSOC 患者经常出现转移，导致预后不良。迄今为止，染色体外环状 DNA(eccDNAs) 已被证明参与癌症基因组重塑，但 eccDNA 在转移性 HGSOC 中的作用尚不清楚。2022 年 4 月 13 日，云序客户浙江大学医学院附属妇产科医院吕卫国/许君芬课题组在 Cell Death & Disease 杂志上发表了文章「Global characterization of extrachromosomal circular DNAs in advanced high grade serous ovarian cancer」。本文通过 Circle-seq 分析探索了 HGSOC 原发性和转移性组织中的 eccDNA 谱，发现 eccDNA DNMT1circle10302690-10302961 可被视为 HGSOC 转移和预后的潜在生物标志物或治疗临床靶点。云序生物有幸提供了本文当中的环状  DNA 测序 (circle-seq)，RNA-seq，环状  DNA Sanger 测序验证，环状 DNA 定量 PCR 等技术服务。

发表期刊：Cell Death & Disease
影响因子：9.0
发表时间：2022 年 4 月 13 日
研究方法：RNA-seq，Circle-seq，环状 DNA Sanger 测序验证，环状DNA定量PCR
文章链接：Global characterization of extrachromosomal circular DNAs in advanced high grade serous ovarian cancer
云序提供服务：
 

技术路线

1、Circle-seq 分析检测 HGSOC 样品中的 eccDNAs
为了检测 HGSOC 配对的原发组织和转移组织 (HGSOC-M) 中的 eccDNAs，作者对四对标本进行了环状  DNA 测序 (Circle-seq) 分析。图 1 列出了 Circle-seq 分析方法的主要步骤。首先，使用柱层析分离总环状 DNA。分离的样品用内切酶和限制性核外切酶处理，以去除线粒体环状 DNA 和残留的线性染色体 DNA。然后使用 φ29 DNA 聚合酶通过滚动循环扩增纯化后的 eccDNAs，扩增产物最终通过高通量测序定位到参照基因组 (UCSChg19) 进行分析。circle-map 软件分析结果显示，所有样本中共鉴定出 194955 个 eccDNAs，说明在 HGSOC 组织中有丰富的 eccDNA 表达。
 

2、在 HGSOC 样本中检测到的 eccDNAs 的特征
然后，作者对 HGSOC 原发组织和转移组织的 eccDNA 以下特性进行了表征：表达频率、长度分布、GC 含量和基因组分布。首先，作者发现这些 eccDNAs 来源于所有的染色体 (图 2A)。比较每个样本中 eccDNAs 的表达频率，发现在原发肿瘤中为 32113～48817，在转移性肿瘤中为 12871～70530 不等。其次，大小分布分析显示，大小小于 1000bp 的 eccDNAs 在 HGSOC 组织中为优势亚型。HGSOC 原发组织 eccDNAs 平均大小为 388bp，转移性组织平均大小为 379bp，均在 316～398bp 左右达到峰值 (图 2B)。第三，与其他基因组区域相比，原发组织和转移组织的 eccDNA 序列中 GC 含量的富集程度更高 (图 2C)。第四，通过将 eccDNAs 定位到不同的基因组元件 (图 2D)、重复元件 (图 2E) 和不同的染色体 (图 2F)，探讨了 eccDNAs 的可能起源。在这两组样本中，基因丰富的染色体与 eccDNA 形成频率之间没有普遍的相关性 (图 2F)。值得注意的是，eccDNAs 在 5『UTR 区和 3』UTR 区，以及重复元件如卫星，长分散元件 LINEs，和短分散元件 SINE 处丰富，表明在 HGSOC 组织中，这些区域而不是高基因丰度区域更优先生成 eccDNAs。

 
3、eccDNAs 在 HGSOC 配对的原发和转移组织中差异表达
根据 Circle-seq 测序结果，与 HGSOC 的原发组织相比，在转移组织中筛选出 464 个差异表达的 eccDNAs，筛选阈值为|FC|≥ 2 和 P<0.05(图 3A)。为了证实 eccDNAs 的存在，作者采用扫描电镜显微镜 (SEM) 和透射电子显微镜 (TEM) 观察了 HGSOC 样本以及 SKOV3、A2780 和 OVCAR3 卵巢癌细胞系中的 eccDNAs。可视化清楚地显示了 HGSOC 组织和三种卵巢癌细胞系中 eccDNA 直观的环状结构 (图 3B，C)。
   
4、验证在 HGSOC 原发性和转移性组织样本中差异表达的 eccDNAs
作者还通过 RNA-seq 分析确定了同一原发性和转移性 HGSOC 肿瘤之间的差异表达基因 (DEGs)(图 4A,B)。与原发组织相比，在转移组织中鉴定得到了 219 个 DEGs，包括 91 个上调 mRNA 和 128 个下调 mRNA。此外，将 Circle-seq 数据与 RNA-seq 结果进行联合分析，发现 64 个改变的候选基因存在重叠 (图 4c)。同时，作者对这些差异表达的 eccDNAs 和 mRNA 进行 GO 和 KEGG 分析，发现这些候选基因的主要潜在下游功能包括代谢调节、血管生成调节和细胞死亡等。根据生物信息学分析预测的癌症相关功能和 eccDNAs 的表达程度，作者选择了 8 个 eccDNA 进行进一步的研究。这些 eccDNA 按其基因起源命名，如 DNMT1circle10302690-10302961。

此外，作者应用环状 DNA Sanger 测序来确定检测到的 eccDNAs 的连接位点，确定了以下 6 个 eccDNAs 的准确基因来源：
TIAM1^{circle32908504-32909034}/TIAM1^{circle32908506-32909036}
PKNOX1^{circle44449654-44450167}
DNMT1^{circle10302690-10302961}
ABI3BP^{circle100704857-100705232}
RORA^{circle60976547-60977116}/RORA^{circle60976549-60977118}(图4D)。

为了进一步验证测序结果，作者使用另外 20 对 HGSOC 的原发性和转移性组织进行了环状 DNA 定量 PCR 验证(图4E)。结果显示，DNMT1 mRNA 和 DNMT1^{circle10302690-10302961} 是在 HGSOC 原发和转移组织中表达水平变化最大的候选基因，因此选择 DNMT1^{circle10302690-10302961} 进行进一步研究。

 
5、与 HGSOC 的原发组织相比，DNMT1^{circle10302690-1030296}1 在转移组织中表达下调
eccDNA DNMT1^{circle10302690-10302961} 由 19 号染色体反义链上的一个 DNMT1 基因片段(chr19：10302690-10302961)环化形成。为了验证其特殊的环状结构，在 SKOV3、A2780 和 OVCAR3 细胞系中，对DNMT1^{circle10302690-10302961} 进行反向 PCR 检测。结果显示，DNMT1^{circle10302690-10302961} 在基因组 DNA 中没有出现(图 5A)。在 SKOV3、A2780 和 OVCAR3 细胞中，使用特异性 cy3 标签探针，也发现了DNMT1^{circle10302690-10302961} 的存在(图 5B)。代表 DNMT1^{circle10302690-10302961} 的信号主要在染色体外观察到，确定了该 eccDNA 的染色体外特征。然后，作者通过 FISH 和 BaseScope 检测验证了 DNMT1^{circle10302690-10302961} 在 HGSOC 原发和转移组织中的表达(图 5C，D)，证实了与 HSGOC 的原发组织相比，其表达水平在转移性组织中显著下调。
6、DNMT1^{circle10302690-10302961} 的减少与 HGSOC 患者预后不良相关
采用 4 个在线数据库(TCGA、GSE9891、GSE26712 和 GSE102073)分析 DNMT1 表达水平与 HGSOC 患者预后的关系。Kaplan-Meier 生存分析显示，DNMT1 的低表达与卵巢癌患者的短总生存期(OS)相关(图 6A)。由于eccDNA DNMT1^{circle10302690-10302961}和 DNMT1 mRNA 在 HGSOC 转移性组织中的表达均降低，作者推测 DNMT1^{circle10302690-10302961} 可能也具有这样的预后价值。因此，作者通过 FISH 检测证实了 80 例 HGSOC 患者的 FFPE 组织中 DNMT1^{circle10302690-10302961} 的表达水平。根据特异性探针信号的强度和范围，将所有病例分为 DNMT1^{circle10302690-10302961} 的低表达组和高表达组(图 6B)。进一步的 Kaplan-Meier 生存分析显示，原发性HSGOC 肿瘤中 DNMT1^{circle10302690-10302961} 的低表达，与较短的 OS (图 6C)和较低的无病生存(DFS)率(图 6D)相关。研究结果表明，DNMT1^{circle10302690-10302961} 的减少是 HGSOC 的一个不良预后因素。 本文利用 Circle-seq 分析得到了 HGSOC 原发和转移性组织的 eccDNA 表达谱，并通过与 RNA-seq 联合分析鉴定了一个名为 DNMT1circle^{10302690-10302961} 的新型 eccDNA。与 HGSOC 原发肿瘤相比，DNMT1circle^{10302690-10302961} 已被证实是转移性肿瘤中下调最显著的 eccDNA。此外，作者还确定了 DNMT1circle_{^{10302690-10302961}} 在 HGSOC 诊断中的临床价值，即 DNMT1circle^{10302690-10302961} 的减少与 HGSOC 患者预后不良相关，它可以作为 HGSOC 转移治疗的一个可靠的临床治疗靶点。 云序生物是国内最早提供环状 DNA 测序服务的公司，早在 2018 年已启动了环状 DNA 测序技术的开发。2019 年，云序率先发布了组织细胞环状  DNA 测序（circle-seq），并成为 A&A Biodu 家代理（该品牌的环状 DNA 纯化柱被绝大部分环状 DNA 高分文章采用）。2020 年，云序又相继发布了体液样品环状 DNA 测序及体液样品环状 DNA 甲基化测序服务，均为全国 shou 发，并成为国内环状 DNA 产品线最全的测序公司。迄今为止，我们已经完成上千例样品的环状 DNA 测序，积累了丰富的项目经验，样品类型涵盖：组织﹑细胞﹑血清﹑血浆﹑尿液等，物种涵盖：人﹑小鼠﹑大鼠﹑拟南芥﹑果蝇﹑酵母﹑非洲爪蟾等。2021 年，云序生物的客户率先发表国内首批 eccDNA 研究论文，其中更有发表于 Nature Communications  上的高分研究。
 

1.组织细胞环状 DNA 测序

组织细胞环状  DNA 测序
云序生物基于 circle-seq 的方法，采用多种手段包括柱纯化去除基因组 DNA、酶消化去除线性 DNA 和线粒体 DNA、滚环扩增放大信号，高效地纯化和富集环状 DNA，再利用 NGS 测序和生信分析识别环状 DNA。结合优化的实验流程，本环状 DNA 测序服务具有检出率高﹑准确性好等优点。

技术优势：
使用原装 A&A biotechnology 纯化柱高效富集环状 DNA
滚环扩增放大环状 DNA 信号，提高检出率
专业的生信分析：详尽的注释、丰富的图表
2.体液样品环状 DNA 测序
体液样品环状 DNA 测序
针对血清、血浆、尿液、脑脊液等微量的体液样品，云序生物参考卢煜明教授团队开发的方法，酶切去除线性 DNA 后，利用 Tn5 转座酶，打开 eccDNA 环状结构并同时在 DNA 片段两端加上接头，进行建库及测序。Tn5 转座酶法效率高，损耗低，实现血液循环系统中微量的环状 DNA 的检测。并且本产品能保留环状 DNA 的原始表达量，使得不同环状 DNA 间的表达量的比较更为准确。

技术优势：
减少 DNA 损失
保留原始表达量，不同环状 DNA 间表达量比较更准确

3.体液样品环状 DNA 甲基化测序
体液样品环状 DNA 甲基化测序
针对血清、血浆、尿液、脑脊液等微量的体液样品，云序参考卢煜明教授团队今年研发的方法，酶切去除线性 DNA 后，利用 Tn5 转座酶，打开环状 DNA 环状结构并同时在 DNA 片段两端加上接头，并用酶转化法将未甲基化的 C 转化为 U，进行建库及测序。一次建库测序中同时检测样品中环状 DNA 及其甲基化位点的信息。

技术优势：
一箭双雕：同时检测环状 DNA 及其甲基化状况，节约样品，性价比高
单碱基分辨的环状 DNA 甲基化分析

4.环状 DNA sanger 测序
环状 DNA Sanger 测序
针对测序项目中筛选出的环状 DNA，云序提供 sanger 测序服务验证环状结构。其主要目的在于：为用户提供一种低成本的扩大样品量验证手段，节约实验成本。通过设计反向引物进行 PCR 扩增，将覆盖环状 DNA 连接位点的扩增产物进行 sanger 测序，验证连接位点处序列。

5.A&A Biotechnology 环状 DNA 纯化柱
A&A Biotechnology 环状 DNA 纯化柱
A&A Biotechnology 的纯化柱，是绝大部分环状 DNA 高分文章中所使用的纯化柱。云序生物是该品牌在国内的 wei 一总代理。
  优势一：国内首家提供环状 DNA 测序服务和环状 DNA 甲基化测序的公司，同时也是首家有客户发表 10 分以上 eccDNA 论文的公司。
优势二：环状 DNA 相关服务产品线最全的公司。
优势三： A&A Biotechnology 总代理，采用原装 A&A Bio 纯化柱，环状 DNA 纯化效果好。
优势四：一站式服务：您只需按照送样要求向云序生物寄送样品，我们就能为您完成从环状 DNA 提取，文库制备，上机测序到数据分析整套服务流程。 
优势五：严格质控流程：云序生物质控流程严格，层层把关，为客户提供高准确度的结果。
优势六：专业化生物信息分析：云序生物强大生物信息团队，满足客户个性化数据分析要求。 -- 云序生物eccDNA相关产品 --

组织细胞环状 DNA 测序

体液样品环状DNA 测序

体液样品环状DNA 甲基化测序

环状DNA Sanger 测序验证

A&A Biotechnology 环状DNA 纯化柱

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