染色体外环状 DNA（Exochromosomal circular DNA，简称 eccDNA）是广泛存在于真核细胞中的一类特殊的环状 DNA，近年有越来越多的研究发现 eccDNA 与各类癌症之间的关系。2021 年 9 月，云序客户发表论文揭示食管鳞癌中的 eccDNA 谱学特征（Extrachromosomal circular DNAs are common and functional in esophageal squamous cell carcinoma）；2021 年 11 月，云序客户发表国内首篇影响因子高达 15 分的 eccDNA 研究论文（Focal amplifications are associated with chromothripsis events and diverse prognoses in gastric cardia adenocarcinoma）；进入 2022 年，云序生物的客户又在 Nature 子刊 Cell Death and Disease（IF = 8.469）上发表了一篇 eccDNA 研究文章，揭示了 eccDNA 上的 RAB3B 基因通过诱导细胞自噬而赋予下咽鳞癌细胞顺铂抗药性的原理。

论文标题：Encodinggene RAB3B exists in linear chromosomal and circular extrachromosomal DNA andcontributes to cisplatin resistance of hypopharyngeal squamous cell carcinomavia inducing autophagy
发表杂志：Cell Death and Disease（IF=8.469）
作者院校：中南大学湘雅三医院
实验方法：环状 DNA circle-seq、全转录组测序、环状 DNA Sanger 测序、环状 DNA qPCR 验证 (均由云序生物提供服务)

下咽鳞癌（Hypopharyngeal squamous cell carcinoma ，简称 HSCC）是头颈鳞癌（Head and neck squamous cell carcinoma，简称 HNSCC）的一种，这种疾病预后差，而发病率却在快速上升。顺铂（Cis-Diamino-Dichloro-Platin，简称 Cisplatin 或 DDP）是一种常用于治疗下咽鳞癌的化疗药物，但细胞自噬却会赋予肿瘤顺铂抗药性，对下咽鳞癌的治疗带来不利影响。本文作者使用了下咽鳞癌细胞系 FaDu 和具有顺铂抗药性的下咽鳞癌细胞系 FaDu/DDP 作为实验对象，进行了环状 DNA 的 circle-seq 以及全转录组测序，并通过  Sanger 测序和  qPCR 验证了 RAB3B 基因所在的环状 DNA 的真实存在，发现 eccDNA 上的 RAB3B 基因可通过诱导细胞自噬而赋予下咽鳞癌细胞顺铂抗性。下面我们就来了解一下本文的具体研究思路：
 

 

eccDNA 表达谱

研究者首先研究了 FaDu 细胞和具有抗药性的 FaDu/DDP 细胞的 eccDNA 表达谱（生物学重复 3 vs 3）。云序生物提供了 eccDNA 的 circle-seq 服务：细胞样品中的 DNA 被提取后，通过  A&A 环状 DNA 纯化柱纯化，而后外切酶消化线性 DNA，随后对剩余的环状 DNA 进行滚换扩增，最后经过超声打断后建库测序。
 

在 FaDu 细胞和具有抗药性的 FaDu/DDP 细胞中均有检测到一万个左右的 eccDNA，其中有几千个 eccDNA 含有基因。研究者还对 eccDNA 的长度进行了统计，发现其分布范围从 0.01 kb 到 1000 kb 不等，但在 0.1 kb 和 0.7 kb 附近有两个明显的长度峰的存在。以上这些 eccDNA  表达谱特征在 FaDu 细胞和具有抗药性的 FaDu/DDP 细胞都很相似。
 

在具有抗药性的 FaDu/DDP 细胞中，很大比例（2366/9773）的 eccDNA 上没有基因，较大比例（1958/9773）的 eccDNA 上仅有 1 个基因，但也有 4 个 eccDNA 上具有多达 8 个基因。绝大多数的 eccDNA 基因（3779/5201）仅在 1 种 eccDNA 上发现，但也有 5 个基因在多达 6 种 eccDNA 上发现，甚至更有 1 个基因（CUX1）在多达 8 种 eccDNA 上发现。在 FaDu 细胞中也可以观察到类似的 eccDNA 基因分布趋势。
 

研究者还进一步比较了 FaDu 细胞和具有抗药性的 FaDu/DDP 细胞的 eccDNA 在各条染色体上的分布，除了个别染色体以外，整体而言没有发现两个细胞系之间的明显差异。在各条染色体之间比较 eccDNA 的分布密度，发现基因密度高的 19 号染色体具有最高的 eccDNA 密度，而基因密度低的 Y 染色体则具有最低的 eccDNA 密度。

在 FaDu 细胞和具有抗药性的 FaDu/DDP 细胞之间，找出了 1163 个 eccDNA 上的 2307 个差异表达的 eccDNA（Differentially Expressed EccDNAs，简称 DEEDs）。根据这些 DEEDs 进行的 KEGG pathway 和 GO 生物信息学分析显示，多个与抗药性相关的 KEGG 通路中存在显著上调或下调的 DEEDs 上的基因，多个与细胞抗药性相关的 GO 条目也富集有 DEEDs 上的基因，提示 FaDu 细胞和 FaDu/DDP 细胞之间的 eccDNA 基因表达差异可能是导致其抗药性差异的原因。
    研究者除了进行 circle-seq 检测 eccDNA 以外，还对 FaDu 细胞和具有抗药性的 FaDu/DDP 细胞进行了全转录组测序。将全转录组测序和 circle-seq 进行联合分析，就可以找出两种细胞系之间 mRNA 表达量发生显著变化且 eccDNA 量也发生显著变化的基因。

其中共找到了 7 个 eccDNA 上的 24 个序列完整的基因，它们的 mRNA 和 eccDNA 表达量都在抗药细胞系中显著上调；10 个 eccDNA 上的 11 个序列完整的基因，它们的 mRNA 和 eccDNA 表达量都在抗药细胞系中显著下调。
  为了验证 circle-seq 中分析出的 eccDNA 是否真的以环状的形式存在，研究者选用多个不同类型的 eccDNA 进行了成环位点的 Sanger 测序验证以及环状 DNA 的 qPCR 验证实验。实验结果证明，三个带有蛋白编码基因的 eccDNA 都在细胞中真实存在。其中有一个被证明真实存在的环状 DNA 上带有 RAB3B 基因。 为了找出导致 FaDu/DDP 细胞抗药性的关键基因，研究者选取了数个 mRNA 和 eccDNA 表达量都在抗药细胞系中显著上调的基因，分析它们的基因表达量与 GEPIA 和 TCGA 数据库中 HNSCC 患者的总生存率之间的关系，结果发现仅有 RAB3B 基因与患者的总生存率呈负相关。GEPIA 和 TCGA 测序数据库中的信息还显示，HNSCC 组织中的 RAB3B 基因的表达量也发生了显著上调。因此，研究者认为 RAB3B 基因很可能是导致 HNSCC 患者抗药性和低生存率的原因。为了验证这一假设，研究者随后以 RAB3B 基因为变量，研究 RAB3B 基因与顺铂抗药性之间的关系。

RAB3B 属于小 G 蛋白 RAB 家族，参与了细胞自噬和抗药性的生物过程，作为一个癌基因在多种癌症中被发现报道，但先前并无科学家证明过 RAB3B 在 HSCC 中的致病作用。

本篇论文的研究者用 qPCR 以及 Western Blot 的方法在 FaDu 和 FaDu/DDP 细胞中检测了 RAB3B 的 mRNA 和蛋白表达水平，发现其在抗药性细胞 FaDu/DDP 当中的表达显著上调。通过 shRNA 敲降和质粒过表达来降低或升高 FaDu/DDP 细胞中的 RAB3B 的表达水平，研究者发现敲降 RAB3B 将会降低细胞对 DDP 的抗药性（IC50 降低），而过表达 RAB3B 则会升高细胞对 DDP 的抗药性（IC50 升高）。同时，对细胞自噬标志物 LC3-I 和细胞自噬特异性底物 p62 的 Western Blot 检测结果显示，细胞自噬标志物 LC3-I 到 LC3-II 的转化在 RAB3B 表达时上调，而自噬特异性底物 p62 则在 RAB3B 表达时下调，说明 RAB3B 可以促进细胞自噬的发生。电镜观察显示，RAB3B 敲降细胞中的自噬囊泡显著减少，也说明 RAB3B 可以促进细胞自噬的发生。研究者还构建了下咽鳞癌的肿瘤类器官（Patient-derived tumor organoid，简称 PDO），结果发现顺铂药物处理加上 RAB3B 敲降可对下咽鳞癌 PDO 造成 zui 大程度的打击。

综上可以得出结论，在体外环境下，RAB3B 可以诱导细胞自噬，进而产生顺铂抗药性。
 

本论文的研究者通过环状 DNA 测序/circle-seq  和全转录组测序联合分析，找到了一个包含 RAB3B 基因完整序列的 eccDNA  在顺铂抗性细胞系中显著高表达。体外实验可以证明，RAB3B 可以通过细胞自噬机制赋予细胞顺铂抗药性。由此，研究者推论认为，很可能是因为 RAB3B 的 eccDNA 高表达，转录翻译了大量的 RAB3B 蛋白，通过有诱导细胞自噬机制，最终赋予了细胞顺铂抗药性。

 

云序生物是国内最早提供环状 DNA 测序服务的公司，早在 2018 年已启动了环状 DNA 测序技术的开发。2019 年，云序率先发布了组织细胞环状 DNA 测序（circle-seq），并成为 A&A Bio 的 du 家代理（该品牌的环状 DNA 纯化柱被绝大部分环状 DNA 高分文章采用）。2020 年，云序又相继发布了血清血浆环状 DNA 测序及血清血浆环状 DNA 甲基化测序服务，均为全国 shou 发，并成为国内环状 DNA 产品线最全的测序公司。迄今为止，我们已经完成上千例样品的环状 DNA 测序，积累了丰富的项目经验，样品类型涵盖：组织﹑细胞﹑血清﹑血浆﹑尿液等，物种涵盖：人﹑小鼠﹑大鼠﹑拟南芥﹑果蝇﹑酵母﹑非洲爪蟾等。

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组织细胞环状 DNA 测序

血清血浆环状 DNA 测序

血清血环状 DNA 甲基化测序

环状 DNA Sanger 测序验证

A&A Biotechnology 环状 DNA 纯化柱

1.组织细胞环状 DNA 测序
云序生物基于 circle-seq 的方法，采用多种手段包括柱纯化去除基因组 DNA、酶消化去除线性 DNA 和线粒体 DNA、滚环扩增放大信号，高效地纯化和富集环状 DNA，再利用 NGS 测序和生信分析识别环状 DNA。结合优化的实验流程，本环状 DNA 测序服务具有检出率高﹑准确性好等优点。

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2.血清血浆环状 DNA 测序
针对血清血浆微量样品，云序生物参考卢煜明教授团队开发的方法，酶切去除线性 DNA 后，利用 Tn5 转座酶，打开 eccDNA 环状结构并同时在 DNA 片段两端加上接头，进行建库及测序。Tn5 转座酶法效率高，损耗低，实现血液循环系统中微量的环状 DNA 的检测。并且本产品能保留环状 DNA 的原始表达量，使得不同环状 DNA 间的表达量的比较更为准确。
技术优势：

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3.血清血浆环状 DNA 甲基化测序

针对血清血浆样品，云序参考卢煜明教授团队今年研发的方法，酶切去除线性 DNA 后，利用 Tn5 转座酶，打开环状 DNA 环状结构并同时在 DNA 片段两端加上接头，并用酶转化法将未甲基化的 C 转化为 U，进行建库及测序。一次建库测序中同时检测样品中环状 DNA 及其甲基化位点的信息。技术优势：
技术优势：

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4.环状 DNA sanger 测序
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5.A&A Biotechnology 环状 DNA 纯化柱
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