超详细图文版:如何实现m6A测序数据可视化?
发布时间:2022-02-25 17:39 | 点击次数:
m6A或其他修饰MeRIP测序之后经常会需要通过一种“可视化”方法,直观考察以及展示到文章中个别基因或区域的测序原始信号(coverage)和序列比对情况,即展示甲基化峰。类似的可视化展示也常常应用在一些其他的需要分析信号峰的测序中,如MeDIP-seq、ChIP-seq、ATAC-seq等。今天为大家逐步详细介绍用IGV软件进行甲基化峰可视化的操作方法,其中也囊括了一些常见问题的解答 。
FAQ
Q1: 测序结果中的位点位置在可视化中全部看不到峰?——注意基因组版本选择正确(见3.加载基因组)
Q2: 测序结果中差异位点在IGV中趋势相反、不明显?——注意纵轴scale调整统一(见6.调整图像)
Q3: 样品导入不进去?——注意bam文件与bai文件同名、zoom in 放大看结果(见5.导入样品比对文件)
Q4: 加载基因组报错?——(见3.加载基因组)
Q5: 如何看甲基化峰位在转录本什么区域?文献中peak下方基因转录本示意图是怎么做的?IGV中最下方蓝色转录本,矩形线形箭头都代表了什么,怎么看?——(见4.加载注释文件)
Q6: 如何将样品IP和Input重叠起来看?——(见6.调整图像)
OUTLINE
1.获取IGV软件
2.运行软件
3.加载基因组
4.加载注释文件
5.导入样品比对文件
6.调整图像
7.导出图像
1、获取IGV软件
方式一:
云序生物测序报告中:Report>Sequence_Results>Alignment>IGV software中已经提供了IGV_2.4.10版本的软件压缩包,解压后打开可直接点击igv(.bat)文件运行,无需安装。
*如果运行报错或操作界面错乱,可能由于java版本不对应,可尝试方式二下载java included IGV。
自行从网站下载:
http://software.broadinstitute.org/software/igv/download
下载的版本需要安装:
2、运行软件
点击igv(.bat)文件运行后,等待软件加载。尤其是电脑上第一次运行时等待时间可能会稍长。
3、加载基因组
方式一:
左上角可看到基因组信息,一般软件初始会默认加载的人类基因组Human hg19版本。如果测序数据分析使用的是其他基因组,需要在此选择,此处包含了一些常见基因组版本可直接选择。点击More有更多的基因组版本可供选择。务必与测序分析所使用的版本保持一致。
(云序生物提供的测序服务,使用的基因组版本见报告中:
Report>Sequence_Results>Supplementary>Sample & groups表格中Genome build)
如果是特殊物种不在此列的(或网络等原因加载失败的),则需要自行导入基因组:菜单选择Genomes>Load Genome from File...
(云序生物提供的特殊物种的测序服务,基因组文件如非客户提供,可通过销售提交申请)
4、加载注释文件
通常加载完基因组,IGV软件会自带该物种Refseq注释信息,在最下方。
选择染色体并且zoom in之后可以看到基因组上各位置的具体基因和转录本。
(云序生物提供的测序服务,使用的注释文件见:Report>Sequence_Results>Alignment)
5、导入样品比对文件
前面准备工作做完,要考察样品的可视化情况,需要样品比对到基因组后得到的bam文件,并且其对应的索引文件bai文件需要与其存放在同一文件夹中,勿随意改名,如果一定要改,注意bam与其bai文件前面部分名称要一致。进行可视化时可以直接使用bam文件,也可以将其转化为tdf格式文件后使用。
将bam文件拖入红框区域。
样品刚拖入右侧时,有可能只会显示灰色字“zoom in to see features”。这只是提示需要放大到一定程度才会显示出峰。
方式二:使用tdf文件进行可视化
由于bam文件较大,读取和调整较慢,可以通过IGV内自带的IGV Tools将bam文件转化为tdf文件来进行可视化。相较bam文件,tdf文件去除了alignment track的信息只保留了coverage信息,但文件变小便于快速操作,并且用tdf文件操作时可以进行多样品叠加展示(见后文6调整图像)。
在菜单选Tools>Run igvtools...
*有时出现WARNING: BAM index file...bam.bai is older than ...bam,是提示这个索引文件bai文件比bam文件生成的时间要早,而正常情况下理当先有bam再建立它的bai文件,因此软件提醒注意是否文件有误。一般可能只是由于涉及到原始数据二次下载导致文件生成时间改变,可以忽略这个提示。
tdf文件的使用方式同bam一样,直接将文件拖入IGV。
6、调整图像
导入多个样本后,可以右键track名,进行各种调整和操作,将图像调整到满意的形式展示。可以自己多多尝试。下面例举一些常用的操作供参考。
右键样品名可以改样品名(Rename Track)、更改track的高度、颜色、名字字体大小(Change...)等基本操作。
要对比多个样品中甲基化峰时,会需要将各样品纵坐标scale调整至一致才便于直观比较。
可以 1)根据甲基化峰信号值手动调整个别样品的scale:右键点样本名选Set Data Range后输入最大值;
2)单个样品自动调节至合适的scale:右键点样本名选Autoscale,会自动调整到一个可以显露出该视窗内该样本最高信号值的scale;
7、导出图像
在菜单File>Save Image中导出图像。
导出的图片为当前视窗下的全部内容。
**IGV中其他详细信息,可参阅IGV官网http://www.broadinstitute.org/igv/
云序相关产品
云序生物m6A修饰研究五大模块
01 m6A RNA修饰测序
m6A RNA修饰测序(m6A-MeRIP-seq)
对m6A RNA甲基化,目前zui流行的检测手段为m6A-Seq技术,适用于m6A RNA甲基化谱研究,快速筛选m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多种非编码RNA的m6A测序:
- m6A 全转录组测序(涵盖mRNA,LncRNA,circRNA)
- m6A LncRNA测序(涵盖LncRNA和mRNA)
- m6A Pri-miRNA测序(涵盖Pri-miRNA和mRNA)
- m6A mRNA测序
- m6A miRNA测序
02 检测整体m6A RNA修饰水平
LC-MS/MS检测整体RNA修饰水平
精准高效,可以实现一次检测,9类修饰水平检测,一步到位。
比色法检测整体RNA修饰水平
快速检测m6A整体甲基化水平
03 m6A RNA修饰上游酶的筛选
比色法检测整体RNA修饰水平
寻找上游直接调控m6A RNA甲基化的甲基转移酶。
04 m6A RNA修饰靶基因验证
MeRIP-qPCR
云序提供各类不同修饰的meRIP-qPCR服务,可针对mRNA,lncRNA,环状RNA等不同类型的RNA分子进行检测,低通量验证RNA修饰靶基因表达水平。
05机制互作研究
RIP-seq/qPCR
筛选或验证RNA修饰直接靶点,研究RNA修饰靶基因的调控机制。
RNA pull down -MS/WB
筛选或验证目标RNA互作基因或蛋白,研究相应的分子调控机制。
双荧光素酶实验
验证两基因互作,研究相应的分子调控机制。
ChIP-seq
筛选或验证目标蛋白与DNA互作,研究相应的分子调控机制。
云序生物服务优势
优势一:发表10分以上文章最多的m6A RNA甲基化测序服务平台。云序已累计支持客户发表57篇高水平RNA修饰文章,合计影响因子520分+,是国内支持发文最多、累计影响因子最高的公司。
优势二:至今完成4000+例 m6A测序样本,全面覆盖医口、农口等各类样本。
优势三:全面检测mRNA和各类非编码RNA(circRNA,lncRNA,Pri-miRNA等)。
优势四:du家提供m6A一站式服务:m6A整体水平检测、m6A测序、MeRIP-qPCR验证、RIP和RNA pull-down等。
优势五:率先研发超微量MeRIP测序技术,RNA量低至500ng起。
优势六:国内最全的RNA修饰测序平台,提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、m6Am、O8G、ac4C乙酰化和2'-O-甲基化测序。
云序客户RNA修饰部分文章列表
往期回顾
云序生物 | 2021年客户m6A项目文章汇总1区 IF: 21|云序MeRIP-Seq & RIP-Seq助力肺动脉高压中m6A阅读蛋白YTHDF1机制研究
云序生物zui新“RNA”甲基化研究汇总——m6A修饰之植物篇
云序项目文章纯测序发表7分杂志|西北农林猪精子m6A修饰文章
项目文章|赫捷院士团队揭密肺腺癌 m6A 机制再次登上Nature 子刊!
项目文章|赫捷院士团队nature子刊揭示METTL3以m6A依赖方式调控食管鳞癌
m6A项目文章|ALKBH5通过调控WNT5A稳定性促进缺血后血管生成
云序客户再发15分文章:FBW7靶向m6A结合蛋白YTHDF2抑制卵巢癌
Science新发现 |RNA以m6A依赖方式调节染色质状态和基因转录
Nat Commun | 云序客户揭示Mettl3协调癌症的生长和转移的分子机制
云序客户余健秀课题组m6A方向再次取得重大发现——SUMO化促进YTHDF2结合m6A修饰的mRNA影响癌症进展
项目文章|Nature子刊m6A修饰携手miRNA揭示脱氧胆酸在胆囊癌中作用机制
云序超微量MeRIP测序技术助力用户m6A甲基化文章连续发表
云序客户zui新成果揭秘:三个月内搞定5分m6A甲基化谱文章?
20分Nature子刊|揭秘神经发育过程中m6A RNA甲基化与组蛋白修饰间的关系
Shanghai Cloud-seq Biotech Co., Ltd
地址:上海市松江区莘砖公路518号18号楼2楼
网址:http://www.cloud-seq.com.cn
电话:021-64878766
邮箱:market@cloud-seq.com.cn