环状 RNA （circRNA）是近年来非编码 RNA 研究领域的明星分子。德国Max Delbrück分子医学中心（Max Delbrück Center for Molecular Medicine）开发和维护的环状 RNA 数据库 circBase 收录了包括人类、小鼠、黑腹果蝇（D.melanogaster）、秀丽隐杆线虫（C.elegans）以及几种腔棘鱼（Latimeria）在内的多个物种的环状RNA 数据，供全世界所有研究者公开访问、查询和下载。虽然 circBase 数据库中包含了数十万环状 RNA 的庞大数据，但却拥有友好的用户使用体验。就算你以前从来都没有接触过 circBase，只消稍稍花上一点时间在电脑浏览器内实际上手操作一遍，你也能轻松掌握从 circBase 中查找并下载环状 RNA 序列的方法。下面，我们就从云序生物提供的环状RNA测序或全转录组测序的结果表格出发，教大家如何快速从 circBase 获取环状RNA 的序列信息。

网站链接：http://circbase.org/
论文引用：Glažar P, Papavasileiou P, Rajewsky N. circBase: a database for circular RNAs. RNA. 2014;20(11):1666-1670. doi:10.1261/rna.043687.113
  在云序生物提供的 HTML 网页版报告当中，有提供 circRNA 的表达谱以及差异 circRNA 的表格。 打开表格文件（此处以差异 circRNA 表格“Differentially Expressed circRNA.xlsx”为例）。 在表格偏右的位置，可以看到 circBaseID 和 source 两列。在此处的截图中，若该环状 RNA 在 circBase 数据库中有对应的记录，则 source 一列标记为“circBase”，而 circBaseID 一列显示该环状 RNA 的编号；若该环状RNA 在 circBase 数据库中没有记录，则 source 一列标记为“novel”，而 circBaseID 一列留空。 以此处截图中的环状 RNA “hsa_circ_0004846”为例，复制该 circBase ID，然后在 circBase.org 网站首页的搜索框中粘贴，随后点击“Search”搜索，网站随后就会返回搜索结果： 在 circBase 网站上，该 ID 记作“circRNA ID”（上方截图从左到右第 4 列）。 除了按照 circRNA ID搜索以外，circBase 的网页搜索还支持按照以下几类要素来搜索环状 RNA：（所有类型的关键词均无需区分大小写）
NCBI RefSeq transcript ID（例如“NM_027671”）；
基因名（例如“Pvt1”）；
基因组坐标（例如“chrII:123456-7891011”）；
Gene Ontology 条目 ID（例如"GO:0017081"）；
DNA或RNA序列（通过网站首页上方标签栏当中的“blat”）。
需要注意的是，云序生物提供的表格当中，环状 RNA 的基因组坐标（第A列，CircRNAID）与 circBase 上的基因组坐标有细微的差别：
1.起始位置编号差异：circBase 网站上的基因组坐标的起始位置的编号，比云序生物提供的基因组坐标的起始位置的编号小1（-1）。例如下方截图当中绿色高亮的环状 RNA，在 circBase 上的起始位点编号是 5168779，而云序生物提供的起始位点编号是 5168780。
2.是否给出正负链信息：云序生物的表格当中，正负链信息以“+”和“-”附加于基因坐标位置的后方（例如下图当中绿色高亮标注的 chr14:55168780-55169298+），但 circBase 网站上则将正负链信息单列为一列（上方截图从左到右第 3列）。

搜索结果的查看和下载

circBase 网站的搜索结果，以表格形式呈现。仍以环状 RNA “hsa_circ_0004846”的搜索结果为例：点击“基因组坐标”（genomic position）一列的超链接，会跳转到 UCSC 的基因组浏览器（circBase 内部镜像版）；点击“最佳转录本”（best transcript）一列的超链接，会跳转到 NCBI 或 WormBase 中相应的转录本信息页面；点击“基因名”（gene symbol）一列的超链接，会跳转到NCBI 或 WormBase 中相应的基因信息页面；点击“环状RNA 研究论文”（circRNA study）一列的超链接，会跳转到 PubMed 中相关参考文献的页面。
circBase 的搜索结果也可以导出下载：点击 Export results 一行的 xlsx、txt 或 csv 字样，就可以将此次搜索结果以对应的格式下载保存。

 
若需要下载环状 RNA 的序列信息，则需要点击 Export results 一行的 fasta 字样。随后，网站将会弹出如下方截图所示的界面。其中，对于序列数据的来源，可以选择基因组序列（genomic）或经过剪接后的 RNA 序列（spliced）；对于序列数据的范围，可以指定向上游或向下游多截取的碱基数目。确定好这些选项后，点击“Search”按钮即可下载环状 RNA 的序列信息。 仍以环状 RNA “hsa_circ_0004846”的搜索结果为例：若序列来源选取的是“spliced”，不额外截取更多碱基，下载的序列长度将会是 519 bp。对于外显子来源的环状 RNA（云序生物提供表格的“Catalog”一列标记为“exonic”的环状 RNA），建议使用这种设定。 若序列来源选取的是“genomic”，不额外截取更多碱基，下载的序列长度将会是 11001 bp，即该 circRNA 来源的基因组区域的全长片段。 到此为止，你就已经掌握 circBase 查找和下载环状 RNA 的基本方法了。怎么样？是不是很简单！

批量搜索环状 RNA

除了简易的单次搜索以外，circBase 也支持一次性对多个环状 RNA 进行批量搜索。只需点击网站首页上方标签栏当中的“list search”就能进入批量搜索的界面。 首先，点选“Organism”的下拉菜单，选取物种；然后，在“Search list”空白区域输入需要批量检索的环状 RNA 的信息（例如具体的 circRNA ID 名、具体的基因组坐标等），也可在“Upload file”处浏览本地文本文件上传；随后，点击页面下方的“Search”按钮，网站就将返回批量搜索的结果表格。

批量筛选环状 RNA

如果不知道每个环状 RNA 的详细信息（例如具体的 circRNA ID 名、具体的基因组坐标等），但仍希望进行批量检索，circBase 还支持设定条件来筛选环状 RNA。只需点击网站首页上方标签栏当中的“table browser”就能进入批量筛选的界面。在此界面选定各个筛选条件，随后点击页面下方的“Search”按钮，网站就将返回批量筛选的结果表格。

 

注意事项

当通过基因组坐标搜索环状 RNA 时，为避免在不同物种之间发生混淆，最好在关键词后加上空格+三字母物种名缩写。例如：以“chr14:55168780-55169298 hsa”作为搜索关键词，就能得到人类基因组上的 14 号染色体的55168780-55169298 区域搜索到的环状 RNA 结果。除了用“hsa”表示人类以外，circBase 中的三字母物种名缩写还有：“mms”表示小鼠；“cel”表示秀丽隐杆线虫；“dme”表示黑腹果蝇；“lcm”表示Latimeria chalumnae；“lme”表示 Latimeria menadoensis。
对于下载得到的文本文件，Windows 电脑用户可能会遇到换行格式的不兼容问题（因为 circBase 下载的文件默认采用 Unix-style 的 LF 换行）。如果遇到换行格式问题，circBase 官方建议您使用免费的第三方文本编辑器Notepad++  打开。
对于下载得到的序列文件，circBase 将使用 gzip 对序列文件进行压缩，得到 Unix 系统下默认支持的 tar.gz 格式的压缩包。Windows 电脑用户若遇到无法解压 tar.gz 压缩包的问题，circBase 官方建议您使用免费的第三方解压软件  7-Zip 或 Powerarchiver 进行解压。
如果您的搜索结果当中的 circRNA 数量超过一条 ，下载解压后得到的每个 fasta 文件将会包含搜索结果当中同一物种的多条不同 circRNA。
  云序生物作为国内早期提供环状RNA测序的测序公司，自行建立的环状RNA数据库circDB，凭借物种覆盖广、数据量大、疾病背景多的特点为客户提供优质的服务。云序积累了超过10000例环状RNA测序的经验，样本覆盖20多个物种以及50多种疾病。云序生物提供系统性环状RNA服务，从筛选（circRNA测序）到验证（qPCR）再到机制研究（RIP、RNA pull-down、ChIP）以及上游表观调控（m6A甲基化等各类RNA修饰研究），全方位覆盖环状RNA上下游分子机制验证的重要研究环节。除了提供组织和细胞的样本类型测序之外，我们还提供体液、血清血浆、外泌体石蜡样本等特殊样本的测序服务。
  一、 环状RNA筛选：
1.1 circRNA测序
1.2 全转录组测序（同时检测circRNA、lncRNA、mRNA) 
二、环状RNA验证
2.1 qRT-PCR
对选定目标RNA分子可进行qPCR检测服务，包括引物设计与表达鉴定。
2.2 Sanger测序与RNase R酶耐受实验
对选定的环状RNA分子进行反式剪切位点引物设计，扩增后Sanger测序验证环状；使用RNase R酶处理环状RNA分子，验证环状RNA分子稳定性。 
三、 CircRNA功能机制研究
3.1 RIP测序/RIP-qPCR
针对目标蛋白抗体把蛋白-RNA复合物沉淀下来，并对复合物上的RNA进行测序或对目标RNA进行qRCR表达分析。
3.2 RNA pull-down+MS/WB/qPCR/RNA-Seq
设计目标RNA生物探针把相应的结合蛋白质与RNA复合物沉淀下来，蛋白质谱检测或WB检测与RNA结合的蛋白。设计目标RNA生物探针把相应的结合蛋白质与RNA复合物沉淀下来，qPCR检测或RNA-seq检测与RNA结合的RNA。
3.3 双荧光素酶报告实验
双荧光素酶报告实验检测两个基因之间的互作。
3.4 chip 测序/chip-PCR
检测转录因子或者组蛋白与下游基因的结合情况。 
四、CircRNA修饰研究
4.1 m6A/m5C/ac4C/m7G/m1A等修饰
针对环状RNA各类修饰进行高通量筛选。
4.2 MeRIP-circRNA-PCR验证
对高通量测序的结果，通过qPCR进行进一步验证。

 

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