文章导读
顶jian国际学术期刊《Nature》和《Cell》上相继发表了染色体外环状DNA(extrachromosomal circular DNA，eccDNA)促进肿瘤发生的报道使eccDNA成为了基因组学研究的“明星”分子。云序生物紧跟“潮流”，是国内最早提供eccDNA测序服务并且唯yi有10分以上文章发表的环状 DNA 测序（circle-seq）服务平台的公司。近期，云序客户连发两篇eccDNA文章，既包括多组学联合分析类文章（国内首篇，15分！云序circle-seq助力国内首篇10分以上环状DNA研究），又有单纯测序发表的文章（山东大学齐鲁医院田辉教授团队在Annals of TranslationalMedicine期刊上发表了eccDNA表达谱文章）。通过circle-seq等高通量测序技术，作者首次揭示了食管鳞癌中的eccDNA表达谱，并探究了eccDNA在食管鳞癌中的潜在机制，为食管鳞癌的临床诊断、治疗等提供了进一步的见解。仅通过测序数据分析，加上qPCR和Sanger测序验证，就可以在3-6个月内短、平、快发表文章！

发表平台：Annals of Translational Medicine
发表日期：2021年9月9日
样本数量：癌组织 vs癌旁组织（3 vs 3）
研究方法:   环状 DNA 测序（circle-seq）、环状DNA Sanger测序
文章链接：Extrachromosomal circular DNAs are commonand functional in esophageal squamous cell carcinoma

食管鳞癌是癌症相关死亡的主要原因。食道癌在癌症的发病率排名第七，在世界范围内癌症相关的死亡率第六。迄今为止，食管鳞癌高发病率和预后差的分子机制尚未完全阐明。虽然最近的研究已经证明了eccDNA在各种肿瘤中的存在，但迄今为止，还没有探究eccDNA在食管鳞癌中的分布和功能。最近，高通量测序表明，在母体和胎儿血浆中eccDNA的大小分布是不同的。此外，肺癌样本中发现的eccDNA比配对正常组织中的更长，并且肺癌手术切除后血浆中循环eccDNA数量减少。这些研究提示，eccDNA的分布可能与肿瘤细胞谱系和某些恶性肿瘤的形成有关。此外，通过对包括食管鳞癌在内的各种肿瘤类型的泛癌分析，数以万计的携带已知癌症驱动基因的eccDNA被识别出来，不过主要集中在肿瘤细胞系或组织样本上，缺乏食管鳞癌和配对正常食管上皮组织中eccDNA分布模式的比较。

（1）食管鳞癌组织中的eccDNA分布
作者首先通过circle-seq高通量测序技术检测食管鳞癌和配对正常食管上皮组织中的eccDNA。eccDNA频率在每条染色体中基本相同，但Y染色体的eccDNA频率要低得多。编码基因数量与各染色体上eccDNA分布频率均无相关性。此外，eccDNA在基因组上的分布主要集中在5’UTR和3’UTR，其次是基因上下2kb以及CpG岛上下2kb。eccDNA全长分布范围为33~968842 bp，95.0%(175363/184557)的eccDNA短于3000bp, 86.1%(158850/184557)短于2000 bp。 （2）食管鳞癌和配对正常食管上皮组织中eccDNA分布模式的比较
接下来，作者根据测序结果对eccDNA在食管鳞癌、正常食管上皮组织中的分布进行了比较。维恩图显示，在184557个eccDNA中，有65809个eccDNA仅在食管鳞癌样本中检测到，4520个eccDNA仅在正常食管上皮中检测到，114228个eccDNA两者共有，但两组样本eccDNA的染色体、基因组以及长度分布模式相似。 （3）食管鳞癌和配对正常食管上皮组织之间差异表达的eccDNA鉴定
分析了两组样本的eccDNA分布模式后，作者接着比较了食管鳞癌和正常食管上皮中eccDNA的表达水平差异。共有16031个差异表达的eccDNA（P-value<0.05 ，|LogFC| >1），其中上调10126个，下调5905个；且只有一小部分差异eccDNA（候选功能性eccDNA）在食管鳞癌和正常食管样本中均检测到。这些候选eccDNA可能是食管鳞癌的潜在生物标志物，并可能参与食管鳞癌的发生和发展。其长度分布范围为44~395,264 bp，且它们主要来自5'UTR和3'UTR。经过分析发现这些上调的eccDNA来源于3219个基因，主要是转录和发育调节因子2（AUTS2）基因。下调的eccDNA来自2235个基因，其中LSAMP、CUB和CSMD1和BICD1基因产生的eccDNA最多。 （4） 差异表达eccDNA相关基因的GO和KEGG通路分析
为了探究差异表达eccDNA相关基因的功能，进行了GO和KEGG分析。发现这些基因主要与神经元、GTPase相关活性和细胞骨架等有关。此外，KEGG通路分析显示，差异表达的eccDNA相关基因主要涉及癌症相关通路、促丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路、局灶粘附和Rap1通路。

（5）食管鳞癌样品中eccDNA的验证
作者接着挑选了部分eccDNA进行PCR验证，包括5个上调和下调的指标。其中，5个上调的eccDNA在至少一种肿瘤样本中强烈表达，而在所有正常上皮样本中均为阴性。同时，5个下调的eccdna在所有肿瘤样本和正常上皮样本中均为阴性。为分析其原因，将高通量测序数据与PCR结果进行了比较，发现只有原始表达值高的eccDNA分子能在PCR中检测到。 通过TOPO-TA克隆和Sanger测序验证反式剪切位点。其中，5个上调的eccDNA连接位点在至少一个PCR阳性产物中被验证到。当eccDNA的起始位点和末端位点的基因组下游有一个或多个相同的核苷酸时，由于高通量测序无法确定连接位点上相同的核苷酸是来自起始位点还是来自末端位点，因此高通量测序显示的末端位点将延伸到真正末端位点下游的一个或多个核苷酸。综上所述，以上验证结果与高通量测序结果一致。 （6）eccDNA成环连接处的motif分析
为探讨eccDNA的产生机制，对每个eccDNA起始和结束位置上游10 bp至下游10 bp的核苷酸组成进行了motif分析。有趣的是，在起始位点和结束位点之间检测到重复的核苷酸模式，这种核苷酸模式可能是导致eccDNA形成的原因。 总结：本文通过对食管鳞癌和配对正常组织进行eccDNA测序（circle-seq），首次揭示了食管鳞癌的eccDNA表达谱，阐明了癌症组和对照组中eccDNA的染色体、基因组以及长度分布情况。并对两组进行差异分析，得到差异上下调的eccDNA，通过功能分析发现主要富集在癌症相关通路，这些eccDNA可能是食管鳞癌的潜在生物标志物，并参与食管鳞癌的发生和发展。最后通过qPCR和Sanger测序验证目标eccDNA。本研究为我们理解基因组可塑性、eccDNA在食管鳞癌中的作用提供了进一步的见解，并可能有助于潜在的临床治疗发展。 云序生物是国内最早提供环状DNA测序服务的公司，早在2018年已启动了环状DNA测序技术的开发。2019年，云序率先发布了组织细胞环状 DNA 测序（circle-seq），并成为A&A Bio独jia代理（该品牌的环状 DNA 纯化柱被绝大部分环状DNA高分文章采用）。2020年，云序又相继发布了血清血浆环状DNA测序及血清血浆环状DNA甲基化测序服务，均为全国首fa，并成为国内环状DNA产品线最全的测序公司。迄今为止，我们已经完成上千例样品的环状DNA测序，积累了丰富的项目经验，样品类型涵盖：组织﹑细胞﹑血清﹑血浆﹑尿液等，物种涵盖：人﹑小鼠﹑大鼠﹑拟南芥﹑果蝇﹑酵母﹑非洲爪蟾等。

云序生物eccDNA相关产品
组织细胞环状 DNA 测序
血清血浆环状 DNA 测序
血清血环状 DNA 甲基化测序
环状 DNA Sanger 测序验证
A&A Biotechnology 环状 DNA 纯化柱
1.组织细胞环状DNA测序
云序生物基于circle-seq的方法，采用多种手段包括柱纯化去除基因组DNA、酶消化去除线性DNA和线粒体DNA、滚环扩增放大信号，高效地纯化和富集环状DNA，再利用NGS测序和生信分析识别环状DNA。结合优化的实验流程，本环状DNA测序服务具有检出率高﹑准确性好等优点。 技术优势：

• 使用原装A&A biotechnology纯化柱高效富集环状DNA
• 滚环扩增放大环状DNA信号，提高检出率
• 专业的生信分析：详尽的注释、丰富的图表

2.血清血浆环状DNA测序
针对血清血浆微量样品，云序生物参考卢煜明教授团队开发的方法，酶切去除线性DNA后，利用Tn5转座酶，打开eccDNA环状结构并同时在DNA片段两端加上接头，进行建库及测序。Tn5转座酶法效率高，损耗低，实现血液循环系统中微量的环状DNA的检测。并且本产品能保留环状DNA的原始表达量，使得不同环状DNA间的表达量的比较更为准确。
技术优势：

• 减少DNA损失
• 保留原始表达量，不同环状DNA间表达量比较更准确

3.血清血浆环状DNA甲基化测序
针对血清血浆样品，云序参考卢煜明教授团队今年研发的方法，酶切去除线性DNA后，利用Tn5转座酶，打开环状DNA环状结构并同时在DNA片段两端加上接头，并用酶转化法将未甲基化的C转化为U，进行建库及测序。一次建库测序中同时检测样品中环状DNA及其甲基化位点的信息。 技术优势：

• 一箭双雕：同时检测环状DNA及其甲基化状况，节约样品，性价比高
• 单碱基分辨的环状DNA甲基化分析

4.环状DNA sanger测序
针对测序项目中筛选出的环状DNA，云序提供sanger测序服务验证环状结构。其主要目的在于：为用户提供一种低成本的扩大样品量验证手段，节约实验成本。通过设计反向引物进行PCR扩增，将覆盖环状DNA连接位点的扩增产物进行sanger测序，验证连接位点处序列。

5.A&A Biotechnology 环状 DNA 纯化柱
A&A Biotechnology的纯化柱，是绝大部分环状DNA高分文章中所使用的纯化柱。云序生物是该品牌在国内的唯yi总代理。 优势一：首家提供环状DNA测序服务和环状DNA甲基化测序的公司。
优势二：环状DNA相关服务产品线最全的公司。
优势三： A&A Biotechnology 总代理，采用原装A&A Bio纯化柱，环状DNA 纯化效果好。
优势四：一站式服务：您只需按照送样要求向云序生物寄送样品，我们就能为您完成从环状DNA 提取，文库制备，上机测序到数据分析整套服务流程。 
优势五：严格质控流程：云序生物质控流程严格，层层把关，为客户提供高准确度的结果。

优势六：专业化生物信息分析：云序生物强大生物信息团队，满足客户个性化数据分析要求。

 

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