外泌体是细胞分泌的大小为40-100nm的盘状囊泡，广泛分布于人体体液。近年来，关于外泌体的研究越来越受到广泛关注。外泌体中携带有多种蛋白质、脂类、RNA等重要信息。通过高通量技术对外泌体 RNA 进行测序，可快速高效获得外泌体 RNA 的全面信息，是疾病诊断和治疗的理想手段。本期分享云序客户华中科技大学同济医学院附属协和医院发表的“A bone-targeted engineered exosome platform delivering siRNA to treat osteoporosis”文章。该研究借助外泌体的内在抗骨质疏松功能，与Shn3基因负载的siRNA合作从而治疗骨质疏松，提供了一种新的疾病治疗思路。云序生物有幸参与了本次研究当中的外泌体microRNA测序与生信分析。

发表期刊：Bioactive Materials
影响因子：14.59
研究方法：外泌体miRNA-seq
文章链接：A bone-targeted engineered exosome platform delivering siRNA to treat osteoporosis （1） BT-Exo-siShn3的构建及检验
作者对iPSCs进行诱导培养最终获得iMSCs衍生外泌体，将SDSSD肽结合到外泌体上对其进行骨靶向修饰，构建骨靶向外泌体（BT-Exo），并通过电穿孔技术将small RNA——siShn3转入BT-Exo。为了验证骨靶向修饰与电穿孔是否会对外泌体内源性miRNA产生影响，作者对BT-Exo-siShn3与Exo进行了miRNA测序（云序提供），结果显示骨靶向修饰与电穿孔对外泌体携带的内源性miRNA没有影响。同时GO分析与KEGG富集分析结果表明，外泌体中Wnt、FoxO和MAPK信号通路与成骨和血管生成密切相关，且许多成骨有关miRNA在外泌体高度表达，表明iMSCs外泌体在成骨与改善血管中具有重要作用。 （2） SDSSD在体外、体内的骨靶向能力
为了验证SDSSD在体外的骨靶向能力，作者用DiR标记的BT-Exo或非骨靶向的Exo孵育成骨细胞2h，BT-Exo组中可观察到更强的荧光信号，证明SDSSD可增强成骨细胞的摄取。CLSM进一步证实了这种特异性摄取。另外，Western blot结果显示在成骨细胞中BT-Exo敲除作用强于内皮细胞（ECs）和Raw264.7（破骨细胞前体）。
为进一步研究BT-Exo在体内的骨靶向能力，用DiR标记的BT-Exo-siShn3或Exo-sishn3注射小鼠静脉，在BT-Exo-siShn3处理的小鼠骨中观察到增强的荧光信号，表明SDSSD修饰可能促进外泌体的骨积累。用木甲醇橙色标记骨形成表面并用绿色荧光追踪siShn3-FAM，在BT-Exo-siShn3发现了大量的红色和绿色荧光共定位，表明BT-Exo-siShn3将siShn3递送到骨形成表面。 （3） BT-Exo-siShn3在体外可促进成骨和血管生成
作者通过ARS染色证明BT-Exo本身具有促进成骨作用而sishn3能够放大这一功能，并分析了骨分化标志物ALP的活性进行了证实。对成骨相关基因进行了RT-PCR检测并对成骨分化的代表性蛋白OSX和氰酸盐标记物进行表达分析后进一步证实了BT-Exo-sishn3可放大BT-Exo的成骨作用，促进成骨。
为了阐明抑制Shn3（成骨细胞激活的抑制子）对SLIT3（具成骨及促血管生成作用）的作用，设置了不同处理与成骨前细胞和ECs共培养，结果表明BT-Exo-siShn3组上清液中SLIT3水平高于其他组。对ECs的血管生成活性进行检测结果表明外泌体可单独促进ECs的血管生成，且siShn3能加强这一作用。 （4） BT-Exo-siShn3可抑制体外破骨细胞的发生
为了阐明BT-Exo-siShn3治疗成骨细胞的同时是否能够抑制破骨细胞的生成，作者设置了不同处理下的成骨细胞与Raw264.7细胞共培养，结果显示BT-Exo-sishn3组分泌较高水平的OPG（骨保护素），但RANKL（可激活破骨细胞）水平较低。TRAP染色、f-肌动蛋白染色结果显示多肽SDSSD对破骨细胞形成无影响，外泌体可抑制破骨细胞形成，而siShn3可加强对破骨细胞生成的抑制作用。同时对代表破骨细胞发生的蛋白和基因，NFATc1和c-Fos的表达进行了检测，与上述结果一致。  （5） BT-Exo-siShn3可防止体内OVX诱导的骨丢失，促进H型血管形成
为了研究BT-Exo-siShn3是否促进体内骨形成和H型血管形成，作者建立了双侧卵巢切除术(OVX)诱导的骨丢失小鼠模型，进行不同的静脉注射处理。股骨远端的显微ct结果显示与其他组相比，BT-Exo-sishn3组的骨微结构有所改善，同时骨靶向的组均比非骨靶向组表现出更好的骨小梁参数，表明靶向运输对于治疗骨质疏松具有重要意义。用于评价动态骨形成的骨荧光参数与力学性能结果均表明BT-Exo-sishn3组表现出最hao的骨形成与骨强度改善效果。Western blot结果显示骨靶向工程外泌体可以在体内介导SHN3基因沉默。为了进一步验证BT-Exo-siShn3是否能抑制体内破骨细胞的发生，作者对骨小梁表面进行TRAP染色，结果显示BT-Exo-siShn3处理组破骨细胞明显减少，说明BT-Exo-siShn3可抑制体内破骨细胞的形成。
作者通过免疫荧光染色检测BT-Exo-siShn3对H型血管形成的影响。BT-Exo-siShn3治疗可以明显减轻OVX小鼠的股骨远端中CD31highEmcnhighECs和OSX阳性骨祖细胞数量减少的现象，BT-Exo-siCon和BT-Exos治疗组在这方面的影响较弱，而非靶向Exo-sishn3没有影响。这些结果表明，OVX诱导H型血管和骨祖细胞显著减少，而成骨细胞靶向传递siShn3可部分改善这种作用。此外，血清中的SLIT3、RANKL浓度检测和骨代谢生化指标表明BT-Exo-siShn3处理降低了RANKL的产生和骨吸收标志物，而增加了SLIT3的分泌和骨形成标志物PINP。并且各处理组的各个组织部位均无明显的组织形态学变化，说明BT-Exo-siShn3治疗耐受性良好，无明显的全身毒性。 文章通过外泌体miRNA-seq技术（云序提供），通过对测序结果比对分析确认骨靶向修饰和电穿孔等人为操作不会对外泌体内源性miRNA含量及表达量产生影响，提高实验的准确性及可信度。同时GO分析表明外泌体中存在miRNA直接参与骨代谢，KEGG富集分析结果表明，外泌体存在多条信号通路与成骨、血管生成密切相关，且许多成骨有关miRNA及破骨细胞抑制性miRNA均在外泌体高度表达，表明iMSCs外泌体在成骨与改善血管中具有重要作用。为iMSCs外泌体在治疗骨质疏松中发挥的作用提供了新思路。
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