近年来，eccDNA（染色体外环状DNA）连登《Nature》《Cell》等期刊，彻底颠覆了人们对基因遗传的传统认知(颠覆性发现：癌基因竟不在染色体上 环状DNA连登Nature，Cell！)，成为了具有潜力的科研新热点（2020国自然研究热点—eccDNA的前世今生）。
近期，NIPT之父卢煜明教授基于转座酶和m5C位点酶学转化方法开发出了eccDNA甲基化测序技术，并揭示了孕妇血浆中的胎儿eccDNA甲基化状况，为eccDNA的深入研究及新型分子标志物的开发提供了新的技术手段。
作为国内提供eccDNA测序服务的公司，云序生物一直是eccDNA领域的领跑者。通过严谨的技术开发和质控，云序正式全国发布eccDNA甲基化测序服务！

A.技术优势
1.一箭双雕：同时检测eccDNA及其甲基化状况，节约样品，性价比高
2.单碱基分辨的eccDNA甲基化分析

B.eccDNA甲基化测序流程
1.EccDNA富集：通过核酸外切酶 V 消化等手段，去除样品中的线性DNA，从而达到富集eccDNA的目的。
2.加接头：通过转座酶打开eccDNA的环形结构，并在DNA片段的两端加上接头。
3.末端修复：通过Klenow酶修复转座产物的末端缺口。
4.C-U转化：通过温和的酶转化法，将未甲基化的胞嘧啶（C）高效地转化为尿嘧啶（U）。
5.PCR扩增：对转化后产物进行PCR扩增及纯化。
6.上机测序：纯化后文库质检合格后进行上机测序。

C.eccDNA甲基化测序质控（云序实例）
实验项目：血浆eccDNA甲基化测序
1.血浆cfDNA Qubit定量
通过Qubit荧光定量仪检测掺入样品DNA的特异荧光染料信号，从而对样品进行精确定量。

2.文库2100质控

通过Agilent生物分析仪对测序文库进行质控。

 

3.FastQC质控

通过FastQC软件进行测序数据质控。

4.Read统计及转化率
对测序碱基质量(Q30)，Read及C-U转化率进行统计。

 

D.eccDNA甲基化测序数据展示

1.eccDNA的识别及甲基化水平
通过软件识别eccDNA的染色体坐标，长度及表达量 ecc_chr: eccDNA的染色体
ecc_start: eccDNA的起始位点
ecc_end: eccDNA的终止位点
ecc_location: eccDNA的染色体坐标
ecc_length: eccDNA的长度
T1，T2: 不同样品中某个eccDNA对应的原始split reads数目
Meth_Level_T1,T2: 不同样品中某个eccDNA的甲基化水平

2.eccDNA的基因注释
对eccDNA所在位置的蛋白编码基因的位置，基因名，基因ID等信息进行注释 chr, start, end: eccDNA所在区域的蛋白编码基因的基因组位置信息
gene_id: eccDNA所在区域的蛋白编码基因的gene ID
gene_name: eccDNA所在区域的蛋白编码基因的基因名
strand: eccDNA所在区域的蛋白编码基因所处的正负链信息
overlap: eccDNA与蛋白编码基因的重叠区域

3.eccDNA长度分布图
eccDNA的长度分布图表明：eccDNA在两个区域富集，一是~200bp的区域，另一个是300-450bp的区域。 4.eccDNA甲基化水平统计
不同功能区域的eccDNA的甲基化水平统计 E.eccDNA甲基化测序样品要求
cfDNA: > 50 ng
血浆：> 5 mL
细胞：> 2 x 107
组织：> 100 mg
其他样品类型咨询021-64878766当地销售

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往期eccDNA主题回顾

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斯坦福大学新研究----肿瘤细胞中ecDNA新机制
Nature重磅新星——eccDNA的物种发现史
2020国自然研究热点—eccDNA的前世今生
eccDNA新型生物标志物，卢煜明团队新重磅成果！
再登Nature Genetics：ecDNA与致癌基因扩增及多种癌症不良预后相关
10分文章新利器----eccDNA开启2020年科研新热点
颠覆性发现：癌基因竟不在染色体上 环状DNA连登Nature，Cell！
Nature Genetics 揭示eccDNA新功能—驱动神经母细胞瘤基因组重排