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斯坦福大学新研究:肿瘤细胞中 ecDNA 机制

发布时间:2021-04-07 11:27 |  点击次数:

文章导读
eccDNA是染色体外的一种特殊的环状DNA,从它的出现至今已长达数年,但在起初的很长一段时间里并未得到人们的重视。随着高通量技术的发展,eccDNA(extrachromosomal circular DNAs,eccDNAs)作为染色体外的环状DNA的研究也进一步深入。在国际学术期刊《Nature》和《Cell》上相继发表的关于eccDNA在肿瘤的发生和发展中具有重要功能的报道使eccDNA成为了基因组学研究中的一个爆点。这两篇文章中认为eccDNA能够促进肿瘤细胞中原癌基因的表达,这一重要发现使eccDNA成为科研界关注的热点话题。
然而关于eccDNA在肿瘤细胞内的空间位置及作用机理仍未可知。近期,美国斯坦福大学研究团队在bioRxiv 预先发表了一篇题目为“EcDNA hubs drive cooperative intermolecular oncogene expression”的文章,对癌症细胞中ecDNA hubs(ecDNA聚集成簇)在致癌基因的表达中发挥重要的作用提出了一个新的分子机制,这为解析ecDNA在癌症细胞中的作用提出一个新方向,也为癌症治疗提供了新的理论基础。
发表平台: bioRxiv 
发表日期: 2020.11.20
实验方法:  WGS, RNA-seq, ChIP(以上服务云序均可提供)
文章链接:EcDNA hubs drive cooperative intermolecular oncogene expression
研究内容
此前研究发现ecDNA是大小约100kb-几Mb的双链环状DNA。由于其自身没有着丝粒,因此在细胞分裂中可随机分配到子细胞,这一特性使ecDNA在肿瘤耐药性方面发挥作用。而且,ecDNA也可以重新整合到染色体上或者形成重复序列(HSRs)。此外,ecDNA相比于染色体DNA有更加松散的结构,更适于其携带的致癌基因的转录和表达。ecDNA存在于正常染色体之外,其在细胞核中的空间组织目前还不清楚。但值得注意的是,ecDNA在某些生物学过程之后会发生聚集。本文中作者展示了由10-100个ecDNA聚集组成的ecDNA簇,它们聚集在间期细胞核内,驱动分子间增强子的重排从而驱动致癌基因表达。本研究中,通过检测在MYC-PVT1融合基因的ecDNA空间、表观和转录水平的动态变化,发现ecDNA hubs作为一个组合的增强子集合体,对致癌基因的转录发挥调控。
研究结果
(1)ecDNA hubs是癌基因转录的主要位点
为了了解ecDNA在转录过程中的空间背景,作者使用DNA荧光原位杂交技术(FISH)分别在前列腺癌(PC3)、结直肠癌(COLO320-DM)、胶质母细胞瘤(HK359)以及胃癌(SNU16)中可视化了ecDNA在间期期间在细胞核中的定位,发现这些ecDNA是几十到几百个聚集在间期细胞的细胞核的特定区域,这表明ecDNA 相互之间具有很强的聚集性,称之为ecDNA hubs。为了评估ecDNA hubs的转录活性,作者结合了DNA和新生RNA利用FISH检测了在PC3和COLO320-DM细胞系中MYC等位基因的转录活性,发现ecDNA  hubs上致癌基因的转录的概率明显高于染色体位点,且发现MYC转录概率与ecDNA聚类之间有显著的相关性。因此,当更多的ecDNA在同一细胞聚集时,ecDNA hubs更有可能转录癌基因。
(2)单细胞水平识别与强效癌基因表达相关的ecDNA增强子
为了了解ecDNA上致癌基因表达的调控,作者在单细胞水平上鉴定了与癌基因高表达相关的ecDNA上的调控元件并检测了癌细胞的异质性,以及ecDNA与癌基因转录的关系。作者采用单细胞组学的方法,使用ATAC- seq和RNA-seq共检测到结直肠癌细胞系col320 -DM和COLO320-HSR中72049个细胞获得的转录组和染色质开放性图谱。进一步整合了每个细胞的转录组和染色质开放性图谱,发现MYC的开放性随RNA表达而增加。MYC在COLO320-DM中的表达与开放性相比于COLO320-HSR是高度异质的。这些结果表明,调控元件可以影响ecDNA在癌基因表达中的细胞间差异。为了鉴定细胞中表达高水平MYC的ecDNA上的活性调控元件,ATAC-seq比较表明,高MYC表达的COLO320-DM细胞既包含更高的ecDNA拷贝数,也包含更多的调控元件,在ecDNA上的差异峰分析鉴定出47个与MYC高表达密切相关的调控元件,而在染色体HSRs上鉴定出5个调控元件,这些结果表明,MYC 转录的增加与ecDNA中许多调节元件有关。总之,这些结果表明,细胞间增强子的差异可能是ecDNA 癌基因表达异质性的关键。
(3)增强子和启动子之间的分子间互作促进ecDNA 的异质化和致癌基因的表达
由于发现(i)细胞核内的ecDNA hubs与活跃的癌基因表达相关,(ii) ecDNA的癌基因表达与差异调节元件相关,作者下一步研究这些差异元件是否参与不同的ecDNA分子之间的增强子-启动子相互作用。作者整合了WGS、单分子DNA测序和3D 增强子连接体图谱,分析ecDNA  hubs对致癌基因表达的调控。先根据之前的WGS的数据,检测COLO320-DM细胞中ecDNA在MYC位点有重排,确定了PVT1能和MYC的外显子2和3发生融合,并采用nanopore三代单分子测序的方法进行了验证,结果显示ecDNA分子在COLO320-DM中存在高度的异质性。随后采用HiChIP检测了COLO320-DM和COLO320-HSR中H3K27ac与激活型增强子和ecDNA的作用,发现在ecDNA的拷贝数高的COLO320-DM中H3K27ac与激活型增强子结合越紧密。此外,通过ATAC-seq鉴定了大量的激活型增强子,结果发现其与MYC基因有相互作用。综上结果,作者认为增强子和启动子之间的互作促进ecDNA的异质化和致癌基因的表达。
(4)BRD4连接ecDNA hubs并驱动癌基因转录
广泛的远距离接触和H3K27ac相关的DNA接触提高了BET蛋白可能参与ecDNA hubs转录的可能性。BET是染色质阅读蛋白,为了检测BET蛋白在ecDNA促进转录作用,检测在两种细胞中MYC位点BRD4的定位情况。根据H2K27ac,BRD4的ChIP-seq结果和ATAC-seq数据,表明H3K27ac 存在的激活的ecDNA增强子,与BRD4同时存在,BRD4连接ecDNA hubs,促进致癌基因的转录。为了评估BET抑制剂JQ1在ecDNA hubs的功能中作用,作者进行了JQ1处理,发现加入JQ1后ecDNA出现分散,且具有细胞特异性。而加入RNA PolII抑制剂,降低MYC的转录但不影响ecDNA hubs的聚集。通过新生RNA和DNA FISH和BRD4的ChIP-seq结果表明ecDNA hubs的形成依赖于BET蛋白,而ecDNA hubs的破坏会引起MYC致癌基因转录的抑制和ecDNA癌细胞的死亡。除了BET的抑制剂会抑制ecDNA的转录,作者还发现CRISPR的干扰剂,也可以抑制PVT1的启动子,降低PVT1-MYC的转录从而降低总的MYC的RNA水平。这一结果显示ecDNA可能是调控致癌基因表达的一个更有效的思路。

(5)EcDNA hubs调控两个癌基因位点的分子互作
上述研究证明ecDNA hubs可能促进分子间增强子-启动子相互作用。为了验证这些相互作用,作者对人类胃癌细胞系中两种类型的ecDNA进行了研究,一种ecDNA包含来自8号染色体的MYC扩增子,另一种包含来自10号染色体的FGFR2扩增子。用FISH分析表明,MYC和FGFR2 ecDNA在间期中心区共表达。后续作者在细胞上使用H3K27ac HiChIP来检测增强子-启动子的相互作用。这些结果说明分子间的相互作用对于致癌基因的表达非常重要。
讨论
本文研究发现癌细胞中携带癌基因的ecDNA成簇出现,形成ecDNA hubs。这种ecDNA hubs促进了新的增强子-启动子相互作用和癌基因表达。反过来,这些增强子在癌基因间的不同导致细胞间的异质性。此外,ecDNA hubs可能还涉及不同ecDNA分子上的转录调控元件,这些转录调控元件也可能调控远距离的基因表达。这一发现在ecDNA上的癌基因调控如何有助于致癌基因转录和癌细胞的异质性上有重要意义。

云序生物eccDNA测序
eccDNA测序(别名:Circle-Seq﹑环状DNA测序)是eccDNA检测利器,可以高通量地对检测样品中的所有eccDNA,具有检出率高﹑准确性好等优点。云序生物eccDNA测序采用多种方法高效地富集和扩增eccDNA,简述如下:首先,利用A&A Biotechnology离子交换柱(云序生物是A&A Biotechnology品牌全线产品的全国总代理)高效富集基因组DNA中的eccDNA,然后利用核酸酶进一步对富集的eccDNA进行消化除去残余线性DNA。富集纯化后,通过滚环扩增获得大量的eccDNA拷贝,再利用NGS测序高通量地检测样品中所有的环状DNA分子。严谨的实验流程,极大地提高了eccDNA的检出率和检测灵敏度。最后,通过严谨的eccDNA生信流程,实现了对eccDNA准确的识别和详细的基因注释,快速找到癌症、肿瘤等疾病机理研究和诊断的靶向eccDNA。       
云序生物eccDNA测序实验示意图

云序生物eccDNA测序优势
1.国内首推eccDNA测序服务
云序生物是国内最早提供eccDNA测序服务的公司,云序在2018年已启动了eccDNA测序技术的开发。迄今为止,我们已经完成上千例样品的eccDNA测序,积累了丰富的项目经验,样品类型涵盖:组织﹑细胞﹑血清﹑血浆﹑尿液等,物种涵盖:人﹑小鼠﹑大鼠﹑拟南芥﹑果蝇﹑酵母﹑非洲爪蟾等。
云序eccDNA测序数据质控:
2.唯yi提供eccDNA一站式服务的公司
云序是唯yi一家提供eccDNA检测和鉴定一站式服务的公司,除了eccDNA测序,云序还可以提供包括eccDNA Outward PCR和Sanger测序在内的一系列eccDNA验证服务。
√ 云序产品1:eccDNA测序
作用:通过NGS测序高通量地检测和识别样品中的所有eccDNA。
√ 云序产品2:eccDNA Outward PCR验证
作用:通过核酸外切酶处理和Outward PCR验证eccDNA的环形结构。

√ 云序产品3:eccDNA Sanger测序
作用:通过金标准的Sanger测序,验证eccDNA特异性的junction位点。

3.专业的生信分析
云序生物对eccDNA进行专业细致的注释,提供eccDNA的染色体信息﹑坐标信息﹑长度信息﹑反式剪切位点信息﹑序列信息﹑对应的基因信息﹑基因的GO条目及KEGG信号通路注释信息等,为后续的研究提供了重要线索和便利。
云序eccDNA生信示例:
1)eccDNA表达和差异分析
eccDNA表达注释 (例子)
2)eccDNA整体统计
     Venn图                 长度分布                  染色体分布

3)eccDNA功能预测
差异eccDNA的GO和KEGG信号通路分析
高质量的数据
云序生物严谨的实验流程和专业的数据分析保证了高质量的结果,eccDNA测序数据与Sanger验证结果完美吻合,实测数据示例如下:
eccDNA测序结果验证
 


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