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项目文章|Nature子刊m6A修饰携手miRNA揭示脱氧胆酸在胆囊癌中作用机制

发布时间:2021-01-12 14:07 |  点击次数:

miRNAs是一类长约22nt的单链小RNA,已经成为多种疾病的关键调控分子。大量研究表明miRNA参与调节生物体内分子过程以及各种疾病的发生过程,但针对m6A甲基化修饰是否会对miRNA调节疾病相关过程产生影响的研究却微乎其微。为了解答这一问题,云序客户通过高通量测序以及多种分子机制研究手段对m6A影响miRNA分子机制的研究进行了揭示,并且在oncogene上发表了相应的研究成果(Deoxycholic acid modulates the progression of gallbladder cancer through N6-methyladenosine-dependent microRNA maturation),本文结合本文结合meRIPmiRNA-seq,qPCR等多种技术,揭示了脱氧胆酸可能在胆囊癌中发挥作用,为胆囊癌提供了一种新的诊治策略。
发表期刊:Oncogene
影响因子7.971
实验方法:  miRNA-seq ,m6A-meRIP-qPCR双荧光素酶实验
文章链接:Deoxycholic acid modulates the progression of gallbladder cancer through N6-methyladenosine-dependent microRNA maturation


研究内容
(1)  人GBC标本中血清DCA水平分析
越来越多的证据表明,BA稳态的失衡是疾病的主要特征,因此作者对正常人和GBC患者的血清进行BAs检测,结果发现,与正常个体不同,GBC患者中大多数血清BA水平明显升高(图1a),这表明BAs稳态被明显破坏,并可能影响疾病的发生和进展。与之相反,DCA(一种继发性游离性BA)被发现在GBC患者中明显降低。此外,与GBC相比,胆囊腺瘤(GA)是一种侵袭性较弱的胆囊疾病,其血清中DCA水平较高(图1b),表明DCA下调水平依赖于癌症表型。这些发现显示DCA可能是一种新的GBC诊断生物标志物。
为了探讨使用血清DCA作为GBC患者诊断生物标志物的可能性,作者评估了受试者工作特征(ROC)曲线。作者发现血清DCA水平的ROC曲线下面积为0.87,高于CA19-9(常规诊断生物标志物)的ROC曲线0.71。此外,血清DCA水平越低,GBC越具有侵袭性,表现为肿瘤块更大且Ki-67表达更强(图1d, e)。因此,血清DCA水平可能是GBC的潜在诊断生物标志物。
并且,DCA水平下降的GBC患者总体生存率较差。此外,单因素回归分析显示,GBC患者的肝脏侵袭性、肿瘤大小、TNM分期、远程转移、淋巴结转移、T分类和血清DCA水平均与生存期密切相关(图1g)。多因素回归分析显示DCA可作为GBC患者预后诊断分子标志物。综上研究结果显示,DCA在GBC患者中表达下调,且与不良临床结果相关,可将DCA确定为GBC的潜在生物标志物。

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(2) DCA在GBC细胞中具有抑瘤作用

近期研究表明,BAs在某些肿瘤中积累可减缓肿瘤增殖说明BAs可能具有抑癌作用。由于胆囊BAs与血清BAs密切相关,作者测定了DCA在胆囊的浓度范围。然后,作者测定了三种人GBC细胞株中DCA浓度范围在nM到 μM范围内的细胞存活率,发现三种GBC细胞的细胞活力在μM范围内均受到影响。为确定DCA是否对GBC发展产生影响,作者在体外通过不同浓度的DCA对NOZ和GBC- SD两种人GBC细胞系的生物学行为进行了评估。DCA处理明显降低GBC细胞活力,且呈剂量依赖性(图2a)。接下来,作者研究了DCA是否影响GBC细胞的增殖。增殖实验结果显示,DCA处理明显减少NOZ和GBC- SD细胞的增殖(图2b),说明DCA可能减缓GBC肿瘤细胞的生长。集落形成试验表明,DCA处理后,NOZ和GBC-SD细胞的集落数量明显减少(图2c)。作者进一步研究了DCA对裸鼠GBC移植瘤生长的影响。通过皮下注射GBC癌细胞给小鼠,然后喂食含有0.1% DCA的饮食或等量的载体。与对照组(vehicle)相比,DCA治疗组肿瘤生长速率(图2d, e)和肿瘤重量(图2f)均明显降低。此外,Ki-67免疫染色对来自不同小鼠的肿瘤的组织病理学分析显示,DCA治疗组的增殖率低于对照组(图2 g)。综上所述,体内外实验结果表明,DCA对GBC具有抑瘤作用。

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(3) DCA降低GBC细胞中miR-92b-3p的表达
作为一种非编码RNA,miRNAs已经成为癌症的关键调控分子。作者进行了高通量miRNA-seq检测,发现DCA处理的NOZ细胞中有26个miRNA的表达与vehicle处理的相比存在明显差异。分析结果显示,在DCA处理后,17个miRNA下调,更小的miRNA被上调(图3a)。对上述处理的NOZ和GBC-SD细胞进行PCR (qPCR)分析显示在下调的miRNA中,下调较明显的是miR-92-3p 。此外,GBC细胞中miR-92b-3p的表达也受DCA剂量依赖性的减少(图3c)。为了进一步探究miR-92b-3p在GBC细胞中的作用,作者建立了稳定过表达miR-92b-3p的NOZ和GBC- SD细胞系,发现miR-92b-3p明显增强了细胞的增殖。miR-92b-3p的异位表达部分减弱了DCA介导的肿瘤生长减缓。此外,作者也分析了miR-92b-3p在手术切除旁组织和GBC组织标本中的表达水平,发现miR-92b-3p在组织中的表达高于旁组织。这些结果显示miR-92b-3p可能参与了疾病进展的不同阶段,并可能导致较差的临床结果。
为了验证该项假设,作者通过数据库研究miR-92b-3p的表达是否与GBC的预后密切相关。然而,在TCGA中没有发现miRNA表达与GBC存活时间的关系,可能是由于样本量小。但作者也发现,miR-92b-3p的高表达与较短的生存时间明显相关。因此,作者测量了miR-92b-3p在GBC组织样本中的表达,结果显示过表达miR-92b-3p的GBC患者总生存时间较低表达miR-92b-3p的患者短。这些数据表明,miR-92b-3p是GBC的一种新的致癌因子,DCA可能通过控制GBC细胞中miR-92b-3p的表达而发挥减少因子的作用。 
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(4) MiR-92b-3p作用于PTEN降低PI3K/AKT信号
为了探究潜在的miR-92b-3p靶基因,维恩图结果显示磷酸酶和紧张素同源基因(PTEN)可能是潜在的候选基因。为了进一步验证,作者使用含有miR-92b-3p 的PTEN 3’-UTR片段的载体进行了双荧光素酶实验。与对照组相比,miR-92b-3p对含有PTEN 3’-UTR的载体的荧光素酶活性表现出剂量依赖性减少NOZ和GBC-SD细胞。然而,在含有突变PTEN 3’-UTR的载体中,miR -92b-3p结合位点发生突变,荧光素酶报告基因的活性未受影响。此外,在NOZ和GBC-SD细胞中,过表达miR-92b-3p会降低PTEN mRNA水平,而敲除miR-92b-3p则会提高PTEN mRNA水平。作者使用AGO2的抗体进行了RNA免疫沉淀(RIP),然后进行qRT-PCR,发现miR-92b-3p和过表达miR-92b-3p的NOZ细胞和GBC-SD细胞的miRNA-RISC复合物中,PTEN mRNA富集。综上所述,这些结果表明PTEN是miR-92b-3p靶向基因。
为了进一步确定miR-92b-3p在GBC细胞中的生物学作用,作者使用NOZ细胞敲低了miR-92b-3p进行了整体RNA表达分析。PI3K/AKT通路在基因集富集分析图中富集。接下来,通过免疫印迹法测定miR-92b-3p对PI3K/AKT信号通路的影响。敲低miR-92b-3p后p-AKT (Ser473)、p-70S6K (Thr389)和p-eIF4EBP1(phospho T37)的蛋白水平明显降低,而在NOZ和GBC-SD细胞中过表达miR-92b-3p则明显升高。这些数据表明,miR-92b-3p通过减少PTEN的表达,作为PI3K/AKT信号的上游因子。此外,DCA处理GBC细胞后下调了miR-92b-3p的表达,PTEN mRNA和蛋白水平明显升高。与上述研究结果一致,DCA处理明显降低了NOZ和GBC-SD细胞的PI3K/AKT信号通路。综上所述,这些结果表明,在胆囊癌中,miR-92b-3p下调可通过上调PTEN来减少致癌PI3K/AKT信号。
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(5) 特定位点的m6A修饰与pri-miR-92b的DCA转录降低相关
有报道称甲基化会影响miRNA成熟,因此研究DCA处理是否会改变pri-miR-92b的甲基化水平也十分关键。首先,作者通过对pri-miR-92b序列进行分析,发现了一个m6A位点。随后通过使用meRIP-qPCR研究了DCA处理是否介导了GBC细胞中pri-miR-92b的m6A水平。后续qRT-PCR结果显示在处理后的细胞中,pri-miR-92b的m6A水平明显降低。此外,下调METTL3消除了DCA处理介导的pri-miR-92b m6A甲基化的改变,揭示了DCA介导的pri-miR-92b的甲基化主要依赖于METTL3。接下来,作者评估了pri-miR-92b、pre-miR-92b和miR-92b-3p在NOZ和GBC-SD细胞中表达水平。发现,DCA处理的细胞中pri-miR-92b的水平明显高于对照组细胞;相反,DCA处理后,pre-mir-92b和miR-92b-3p水平降低。为了验证甲基化调节miR-92b-3p的成熟,作者进行了体外RNA处理实验。在体外,pri-miR-92b与过表达miRNA加工酶DROSHA和DGCR8的HEK293T细胞共孵育。与未甲基化的对应物相比甲基化修饰的pri-miR-92b转化为pre-miR-92b和miR-92b-3p的效率更高。符合pri-miR-92b的成熟与甲基化相关的推测,当pri-miR-92b中的METTL3-催化基序突变时,pri-miR-92b向成熟形态的转化速度明显降低。因为miR-92b-3p影响GBC细胞系的增殖,pri-miR-92b的甲基化可能与GBC的进展密切相关。接下来,meRIP-qPCR检测在GBC组织和邻近正常组织样本中pri-miR-92b的甲基化水平。结果显示,GBC组织中pri-miR-92b的甲基化程度明显高于邻近的正常组织标本。综上所述,这些体外和体内结果证明了DCA通过引起在GBC细胞中的甲基化位点特异性m6A的减少而减缓miR-92b-3p的成熟。
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(6) DCA通过与METTL3结合来破坏METTL3 -METTL14- WTAP复合物
然后作者研究了DCA调节pri-miR-92b的m6A修饰分子机制。越来越多的证据表明METTL3-METTL14-WTAP复合物在在哺乳动物核RNA的m6A沉积中起着关键作用,因此作者研究了DCA对这三个基因表达的影响。然而,包括METTL3在内的这些基因的mRNA和蛋白质水平没有变化,DCA处理GBC细胞时,观察到METTL14和WTAP,说明DCA可能是通过破坏METTL3-METTL14-WTAP复合物发挥作用。作者认为DCA可以直接绑定到一个组件上从而干扰复合物的形成。为了证实这一点,作者进行了两种生化分析。通过药物亲和反应靶稳定性(DARTS)检测,发现METTL3蛋白与DCA在体外直接结合,在NOZ和GBC-SD细胞中均以剂量依赖的方式通过蛋白酶减少其降解。为了进一步验证这一假设,作者进行了免疫共沉淀实验。如预期的那样,在没有DCA处理下METTL3与METTL14和WTAP形成络合物;相反,DCA处理后观察到METTL3与METTL14和WTAP不能形成复合物。这些结果支持了DCA通过与METTL3结合破坏METTL3-METTL14-WTAP复合物从而导致pri-mir-92 b甲基化水平下降从而影响miR-92b-3p成熟。
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(7) DCA通过下调miR-92b-3p表达减缓GBC生长
为了进一步探究miR-92b-3p在GBC中的关键作用,作者在裸鼠皮下接种了体外表达的miR-92b-3p或空载的NOZ细胞,然后给裸鼠喂食含有DCA的食物或等量的载体。与空载体相比,过表达miR-92b-3p提高了细胞的增殖能力,而DCA处理可以提高细胞的增殖能力明显减弱miR-92b-3p介导的肿瘤生长。同样,免疫组化法测定Ki-67、p-AKT (Ser473)、p-70S6K (Thr389)和peIF4EBP1 (phospho T37)发现在DCA处理后增殖率明显降低,AKT信号通路水平明显降低;在GBC中,miR-92b-3p过表达通过靶向PTEN部分挽救了DCA诱导的生长减缓。接下来,作者评估了血清DCA水平与GBC组织标本中miR-92b-3p水平的相关性。结果显示,血清DCA水平与GBC组织标本中miR-92b-3p水平呈负相关。考虑到miR-92b-3p靶向PTEN降低AKT信号通路,作者测量了GBC组织样本中PTEN、p-AKT (Ser473)、p-70S6K (Thr389)和p-eIF4EBP1 (phospho T37)蛋白水平。发现除PTEN外,其余蛋白均与GBC中DCA水平呈负相关,而GBC中DCA水平较低。综上所述,这些结果表明,在GBC组织中存在DCA-miR-92b-3p-PTEN-PI3K/AKT调控轴,这可能为GBC提供了一种新的诊治策略。 
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云序生物m6A修饰研究五大模块
01 m6A RNA修饰测序
m6A RNA修饰测序(m6A-seq)
对m6A RNA甲基化,目前流行的检测手段为m6A-Seq技术,适用于m6A RNA甲基化谱研究,快速筛选m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多种非编码RNA的m6A测序:
√ m6A 全转录组测序(涵盖mRNA,LncRNA,circRNA)
√ m6A  LncRNA测序(涵盖LncRNA和mRNA)
√ m6A  Pri-miRNA测序(涵盖Pri-miRNA和mRNA)
√ m6A  mRNA测序
√ m6A  miRNA测序
02 检测整体m6A RNA修饰水平
 LC-MS/MS检测整体RNA修饰水平
准确高效,可以实现一次检测,9类修饰水平检测,一步到位。
比色法
快速检测m6A整体甲基化水平
03 m6A RNA修饰上游酶的筛选
m6A RNA修饰相关酶PCR芯片
寻找上游直接调控m6A RNA甲基化的甲基转移酶。
04 m6A RNA修饰靶基因验证
meRIP-qPCR
云序提供各类不同修饰的meRIP-qPCR服务,可针对mRNA,lncRNA,环状RNA等不同类型的RNA分子进行检测,低通量验证RNA修饰靶基因表达水平。
05机制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR
筛选或验证RNA修饰直接靶点,研究RNA修饰靶基因的调控机制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
筛选或验证目标RNA互作基因或蛋白,研究相应的分子调控机制。
5.3 双荧光素酶实验
验证两基因互作,研究相应的分子调控机制。

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