miRNAs是一类长约22nt的单链小RNA，已经成为多种疾病的关键调控分子。大量研究表明miRNA参与调节生物体内分子过程以及各种疾病的发生过程，但针对m6A甲基化修饰是否会对miRNA调节疾病相关过程产生影响的研究却微乎其微。为了解答这一问题，云序客户通过高通量测序以及多种分子机制研究手段对m6A影响miRNA分子机制的研究进行了揭示，并且在oncogene上发表了相应的研究成果（Deoxycholic acid modulates the progression of gallbladder cancer through N6-methyladenosine-dependent microRNA maturation），本文结合本文结合meRIP, miRNA-seq,qPCR等多种技术，揭示了脱氧胆酸可能在胆囊癌中发挥作用，为胆囊癌提供了一种新的诊治策略。
发表期刊：Oncogene
影响因子：7.971
实验方法:  miRNA-seq ，m6A-meRIP-qPCR，双荧光素酶实验
文章链接：Deoxycholic acid modulates the progression of gallbladder cancer through N6-methyladenosine-dependent microRNA maturation

研究内容
(1)  人GBC标本中血清DCA水平分析
越来越多的证据表明，BA稳态的失衡是疾病的主要特征，因此作者对正常人和GBC患者的血清进行BAs检测，结果发现，与正常个体不同，GBC患者中大多数血清BA水平明显升高(图1a)，这表明BAs稳态被明显破坏，并可能影响疾病的发生和进展。与之相反，DCA（一种继发性游离性BA）被发现在GBC患者中明显降低。此外，与GBC相比，胆囊腺瘤(GA)是一种侵袭性较弱的胆囊疾病，其血清中DCA水平较高(图1b)，表明DCA下调水平依赖于癌症表型。这些发现显示DCA可能是一种新的GBC诊断生物标志物。
为了探讨使用血清DCA作为GBC患者诊断生物标志物的可能性，作者评估了受试者工作特征(ROC)曲线。作者发现血清DCA水平的ROC曲线下面积为0.87，高于CA19-9（常规诊断生物标志物）的ROC曲线0.71。此外，血清DCA水平越低，GBC越具有侵袭性，表现为肿瘤块更大且Ki-67表达更强(图1d, e)。因此，血清DCA水平可能是GBC的潜在诊断生物标志物。
并且，DCA水平下降的GBC患者总体生存率较差。此外，单因素回归分析显示，GBC患者的肝脏侵袭性、肿瘤大小、TNM分期、远程转移、淋巴结转移、T分类和血清DCA水平均与生存期密切相关(图1g)。多因素回归分析显示DCA可作为GBC患者预后诊断分子标志物。综上研究结果显示，DCA在GBC患者中表达下调，且与不良临床结果相关，可将DCA确定为GBC的潜在生物标志物。

(2) DCA在GBC细胞中具有抑瘤作用

近期研究表明，BAs在某些肿瘤中积累可减缓肿瘤增殖说明BAs可能具有抑癌作用。由于胆囊BAs与血清BAs密切相关，作者测定了DCA在胆囊的浓度范围。然后，作者测定了三种人GBC细胞株中DCA浓度范围在nM到 μM范围内的细胞存活率，发现三种GBC细胞的细胞活力在μM范围内均受到影响。为确定DCA是否对GBC发展产生影响，作者在体外通过不同浓度的DCA对NOZ和GBC- SD两种人GBC细胞系的生物学行为进行了评估。DCA处理明显降低GBC细胞活力，且呈剂量依赖性(图2a)。接下来，作者研究了DCA是否影响GBC细胞的增殖。增殖实验结果显示，DCA处理明显减少NOZ和GBC- SD细胞的增殖(图2b)，说明DCA可能减缓GBC肿瘤细胞的生长。集落形成试验表明，DCA处理后，NOZ和GBC-SD细胞的集落数量明显减少(图2c)。作者进一步研究了DCA对裸鼠GBC移植瘤生长的影响。通过皮下注射GBC癌细胞给小鼠，然后喂食含有0.1% DCA的饮食或等量的载体。与对照组(vehicle)相比，DCA治疗组肿瘤生长速率(图2d, e)和肿瘤重量(图2f)均明显降低。此外，Ki-67免疫染色对来自不同小鼠的肿瘤的组织病理学分析显示，DCA治疗组的增殖率低于对照组(图2 g)。综上所述，体内外实验结果表明，DCA对GBC具有抑瘤作用。

(3) DCA降低GBC细胞中miR-92b-3p的表达
作为一种非编码RNA，miRNAs已经成为癌症的关键调控分子。作者进行了高通量miRNA-seq检测，发现DCA处理的NOZ细胞中有26个miRNA的表达与vehicle处理的相比存在明显差异。分析结果显示，在DCA处理后，17个miRNA下调，更小的miRNA被上调(图3a)。对上述处理的NOZ和GBC-SD细胞进行PCR (qPCR)分析显示在下调的miRNA中，下调较明显的是miR-92-3p 。此外，GBC细胞中miR-92b-3p的表达也受DCA剂量依赖性的减少(图3c)。为了进一步探究miR-92b-3p在GBC细胞中的作用，作者建立了稳定过表达miR-92b-3p的NOZ和GBC- SD细胞系，发现miR-92b-3p明显增强了细胞的增殖。miR-92b-3p的异位表达部分减弱了DCA介导的肿瘤生长减缓。此外，作者也分析了miR-92b-3p在手术切除旁组织和GBC组织标本中的表达水平，发现miR-92b-3p在组织中的表达高于旁组织。这些结果显示miR-92b-3p可能参与了疾病进展的不同阶段，并可能导致较差的临床结果。
为了验证该项假设，作者通过数据库研究miR-92b-3p的表达是否与GBC的预后密切相关。然而，在TCGA中没有发现miRNA表达与GBC存活时间的关系，可能是由于样本量小。但作者也发现，miR-92b-3p的高表达与较短的生存时间明显相关。因此，作者测量了miR-92b-3p在GBC组织样本中的表达，结果显示过表达miR-92b-3p的GBC患者总生存时间较低表达miR-92b-3p的患者短。这些数据表明，miR-92b-3p是GBC的一种新的致癌因子，DCA可能通过控制GBC细胞中miR-92b-3p的表达而发挥减少因子的作用。 
(4) MiR-92b-3p作用于PTEN降低PI3K/AKT信号
为了探究潜在的miR-92b-3p靶基因，维恩图结果显示磷酸酶和紧张素同源基因(PTEN)可能是潜在的候选基因。为了进一步验证，作者使用含有miR-92b-3p 的PTEN 3’-UTR片段的载体进行了双荧光素酶实验。与对照组相比，miR-92b-3p对含有PTEN 3’-UTR的载体的荧光素酶活性表现出剂量依赖性减少NOZ和GBC-SD细胞。然而，在含有突变PTEN 3’-UTR的载体中，miR -92b-3p结合位点发生突变，荧光素酶报告基因的活性未受影响。此外，在NOZ和GBC-SD细胞中，过表达miR-92b-3p会降低PTEN mRNA水平，而敲除miR-92b-3p则会提高PTEN mRNA水平。作者使用AGO2的抗体进行了RNA免疫沉淀(RIP)，然后进行qRT-PCR，发现miR-92b-3p和过表达miR-92b-3p的NOZ细胞和GBC-SD细胞的miRNA-RISC复合物中，PTEN mRNA富集。综上所述，这些结果表明PTEN是miR-92b-3p靶向基因。
为了进一步确定miR-92b-3p在GBC细胞中的生物学作用，作者使用NOZ细胞敲低了miR-92b-3p进行了整体RNA表达分析。PI3K/AKT通路在基因集富集分析图中富集。接下来，通过免疫印迹法测定miR-92b-3p对PI3K/AKT信号通路的影响。敲低miR-92b-3p后p-AKT (Ser473)、p-70S6K (Thr389)和p-eIF4EBP1(phospho T37)的蛋白水平明显降低，而在NOZ和GBC-SD细胞中过表达miR-92b-3p则明显升高。这些数据表明，miR-92b-3p通过减少PTEN的表达，作为PI3K/AKT信号的上游因子。此外，DCA处理GBC细胞后下调了miR-92b-3p的表达，PTEN mRNA和蛋白水平明显升高。与上述研究结果一致，DCA处理明显降低了NOZ和GBC-SD细胞的PI3K/AKT信号通路。综上所述，这些结果表明，在胆囊癌中，miR-92b-3p下调可通过上调PTEN来减少致癌PI3K/AKT信号。
(5) 特定位点的m6A修饰与pri-miR-92b的DCA转录降低相关
有报道称甲基化会影响miRNA成熟，因此研究DCA处理是否会改变pri-miR-92b的甲基化水平也十分关键。首先，作者通过对pri-miR-92b序列进行分析，发现了一个m6A位点。随后通过使用meRIP-qPCR研究了DCA处理是否介导了GBC细胞中pri-miR-92b的m6A水平。后续qRT-PCR结果显示在处理后的细胞中，pri-miR-92b的m6A水平明显降低。此外，下调METTL3消除了DCA处理介导的pri-miR-92b m6A甲基化的改变，揭示了DCA介导的pri-miR-92b的甲基化主要依赖于METTL3。接下来，作者评估了pri-miR-92b、pre-miR-92b和miR-92b-3p在NOZ和GBC-SD细胞中表达水平。发现，DCA处理的细胞中pri-miR-92b的水平明显高于对照组细胞；相反，DCA处理后，pre-mir-92b和miR-92b-3p水平降低。为了验证甲基化调节miR-92b-3p的成熟，作者进行了体外RNA处理实验。在体外，pri-miR-92b与过表达miRNA加工酶DROSHA和DGCR8的HEK293T细胞共孵育。与未甲基化的对应物相比甲基化修饰的pri-miR-92b转化为pre-miR-92b和miR-92b-3p的效率更高。符合pri-miR-92b的成熟与甲基化相关的推测，当pri-miR-92b中的METTL3-催化基序突变时，pri-miR-92b向成熟形态的转化速度明显降低。因为miR-92b-3p影响GBC细胞系的增殖，pri-miR-92b的甲基化可能与GBC的进展密切相关。接下来，meRIP-qPCR检测在GBC组织和邻近正常组织样本中pri-miR-92b的甲基化水平。结果显示，GBC组织中pri-miR-92b的甲基化程度明显高于邻近的正常组织标本。综上所述，这些体外和体内结果证明了DCA通过引起在GBC细胞中的甲基化位点特异性m6A的减少而减缓miR-92b-3p的成熟。
(6) DCA通过与METTL3结合来破坏METTL3 -METTL14- WTAP复合物
然后作者研究了DCA调节pri-miR-92b的m6A修饰分子机制。越来越多的证据表明METTL3-METTL14-WTAP复合物在在哺乳动物核RNA的m6A沉积中起着关键作用，因此作者研究了DCA对这三个基因表达的影响。然而，包括METTL3在内的这些基因的mRNA和蛋白质水平没有变化，DCA处理GBC细胞时，观察到METTL14和WTAP，说明DCA可能是通过破坏METTL3-METTL14-WTAP复合物发挥作用。作者认为DCA可以直接绑定到一个组件上从而干扰复合物的形成。为了证实这一点，作者进行了两种生化分析。通过药物亲和反应靶稳定性(DARTS)检测，发现METTL3蛋白与DCA在体外直接结合，在NOZ和GBC-SD细胞中均以剂量依赖的方式通过蛋白酶减少其降解。为了进一步验证这一假设，作者进行了免疫共沉淀实验。如预期的那样，在没有DCA处理下METTL3与METTL14和WTAP形成络合物；相反，DCA处理后观察到METTL3与METTL14和WTAP不能形成复合物。这些结果支持了DCA通过与METTL3结合破坏METTL3-METTL14-WTAP复合物从而导致pri-mir-92 b甲基化水平下降从而影响miR-92b-3p成熟。
(7) DCA通过下调miR-92b-3p表达减缓GBC生长
为了进一步探究miR-92b-3p在GBC中的关键作用，作者在裸鼠皮下接种了体外表达的miR-92b-3p或空载的NOZ细胞，然后给裸鼠喂食含有DCA的食物或等量的载体。与空载体相比，过表达miR-92b-3p提高了细胞的增殖能力，而DCA处理可以提高细胞的增殖能力明显减弱miR-92b-3p介导的肿瘤生长。同样，免疫组化法测定Ki-67、p-AKT (Ser473)、p-70S6K (Thr389)和peIF4EBP1 (phospho T37)发现在DCA处理后增殖率明显降低，AKT信号通路水平明显降低；在GBC中，miR-92b-3p过表达通过靶向PTEN部分挽救了DCA诱导的生长减缓。接下来，作者评估了血清DCA水平与GBC组织标本中miR-92b-3p水平的相关性。结果显示，血清DCA水平与GBC组织标本中miR-92b-3p水平呈负相关。考虑到miR-92b-3p靶向PTEN降低AKT信号通路，作者测量了GBC组织样本中PTEN、p-AKT (Ser473)、p-70S6K (Thr389)和p-eIF4EBP1 (phospho T37)蛋白水平。发现除PTEN外，其余蛋白均与GBC中DCA水平呈负相关，而GBC中DCA水平较低。综上所述，这些结果表明，在GBC组织中存在DCA-miR-92b-3p-PTEN-PI3K/AKT调控轴，这可能为GBC提供了一种新的诊治策略。 
云序生物m6A修饰研究五大模块
01 m6A RNA修饰测序
m6A RNA修饰测序（m6A-seq）
对m6A RNA甲基化，目前流行的检测手段为m6A-Seq技术，适用于m6A RNA甲基化谱研究，快速筛选m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多种非编码RNA的m6A测序：
√ m6A 全转录组测序（涵盖mRNA，LncRNA，circRNA）
√ m6A  LncRNA测序（涵盖LncRNA和mRNA）
√ m6A  Pri-miRNA测序（涵盖Pri-miRNA和mRNA）
√ m6A  mRNA测序
√ m6A  miRNA测序
02 检测整体m6A RNA修饰水平
 LC-MS/MS检测整体RNA修饰水平
准确高效，可以实现一次检测，9类修饰水平检测，一步到位。
比色法
快速检测m6A整体甲基化水平
03 m6A RNA修饰上游酶的筛选
m6A RNA修饰相关酶PCR芯片
寻找上游直接调控m6A RNA甲基化的甲基转移酶。
04 m6A RNA修饰靶基因验证
meRIP-qPCR
云序提供各类不同修饰的meRIP-qPCR服务，可针对mRNA，lncRNA，环状RNA等不同类型的RNA分子进行检测，低通量验证RNA修饰靶基因表达水平。
05机制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR
筛选或验证RNA修饰直接靶点，研究RNA修饰靶基因的调控机制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
筛选或验证目标RNA互作基因或蛋白，研究相应的分子调控机制。
5.3 双荧光素酶实验
验证两基因互作，研究相应的分子调控机制。
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