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再登Nature Genetics:ecDNA与致癌基因扩增及多种癌症不良预后相关

发布时间:2020-10-22 17:38 |  点击次数:

文章导读
研究发现,许多扩增的原癌基因,并不只是位于染色体,而且还能变成游离的染色体外DNA(ecDNA),并出现大量拷贝,而且相当高比例的ecDNA是以环状DNA分子的形式存在,即eccDNA(染色体外环状DNA)。由于ecDNA不存在着丝粒,所以在细胞有丝分裂时,无法被均等地分配到两个母细胞中,这就导致ecDNA的拷贝数会随着细胞代数的增加而呈现巨大的异质性,从而驱动肿瘤演化过程,但是关于ecDNA发生频率和临床影响尚不清楚。
2020年8月17日发表在Nature genetic(IF=27.603)上的一篇题为《Extrachromosomal DNA is associated with oncogene amplification and poor outcome across multiple cancers》的文章揭示了ecDNA与致癌基因扩增及多种癌症的不良预后间的相关性。通过对3212名癌症患者的全基因组测序数据的分析,研究人员发现ecDNA扩增通常发生在大多数癌症类型中;与线性DNA相比,ecDNA扩增而引起的癌基因转录水平更高,同时染色质的可及性得到增强,能够更频繁地与转录本融合;携带ecDNA的癌症患者的生存期也明显短于非ecDNA癌基因扩增引起的癌症患者。此次研究结果表明,基于ecDNA的癌基因扩增在癌症中普遍存在,并导致许多癌症类型的患者预后不良。

发表期刊:Nature Genetics
影响因子:27.603
实验方法Circle-Seq全基因组测序ATAC-Seq
文章链接《Extrachromosomal DNA is associated with oncogene amplification and poor outcome across multiple cancers》


研究内容
1. ecDNA扩增广泛存在于各种癌症类型中
癌基因扩增是癌细胞中最常见的功能获得性改变,使肿瘤细胞能够规避体内平衡期间的制约和平衡,从而驱动肿瘤生长。基于ecDNA的扩增一直被认为是细胞增加特定基因拷贝数(CN)的一种方法,但它们的发生频率尚不清楚。最近,全基因组测序(WGS)数据的计算分析和新的环状DNA文库富集方法表明,在中枢神经系统的肿瘤中ecDNA的频率相对较高。
研究人员应用AmpliconArchitect基于 WGS肿瘤组织的数据,与正常组织和血液癌症基因组图谱(TCGA) (n = 3731)比较,通过全基因组的泛癌分析(PCAWG)(n = 1291)量化并区分结构区域大于10kb,超过4倍(CN > 4,样本中位数以上倍数)的扩增子,这些扩增子分为(1)‘环状’(图1a),表示存在于染色体外的扩增子;(2)‘BFB’,带有由‘断裂-融合-桥’(BFB)机制创建的标记;(3)‘重排列’,指含有来自不同染色体或染色体上相距很远的DNA片段的非环状扩增子(>1 Mb);(4)‘线性’,表示线性扩增。扩增子状态是肿瘤标本分类的依据。缺乏扩增的样本标记为“未检测到局部体细胞CN扩增”(图1a)。 
测序结果表明,AmpliconArchitect在区分环状DNA扩增子和线性DNA扩增子方面,WGS和环状DNA测序(Circle-Seq)方法具有非常高的一致性(图1b),表明分类的可靠性。基于AmpliconArchitect分类WGS中的 3212个肿瘤样本数据集和1810个非肿瘤数据集,研究人员从中发现460例(14.3%)肿瘤样本进行1或多个环状扩增子,证明在癌症中ecDNA扩增是一种常见的事件。相比之下,环状扩增在匹配的全血或正常组织样本中几乎检测不到(图1c)。环状扩增子频率的分布与早期癌症模型的结果一致,表明ecDNA扩增是多种癌症亚型的明确特征,而非正常细胞。
图 1 肿瘤与非肿瘤组织的环型扩增子发生频率
2. 复发性癌基因扩增往往发生在ecDNA上
579个环状扩增子的染色体分布与非环状扩增子的染色体区域相比是非随机的(图2a)。在24个最常复发的扩增癌基因中,有38%最常出现在环状扩增子上,其中PAX8占11%,CDK4占62%(图2b)。在至少5个样本扩增的1,804个癌基因列表中,21.8%的癌基因具有多个环状结构扩增。对于高度扩增的癌基因(即CN > 8),这一比例进一步增加到53.5%。中枢神经系统中癌基因的环状扩增比非环状扩增更高。通过进一步观察,ecDNA结构和癌基因扩增之间的关联并未延伸到断点。对于24个频繁扩增的癌基因,在单位间隔内观察特定数目断点的频率呈指数衰减,这与在癌基因周围的大多数随机发生保持一致(图2c)。这些结果表明,ecDNA是通过随机过程形成的,对促生长癌基因高拷贝的选择导致癌基因在肿瘤发育过程中快速扩增,而由于其遗传不均一,保留了瘤内的遗传异质性。
图 2 环型扩增子的癌基因含量和结构成分
3.与线性DNA相比,ecDNA扩增导致的癌基因转录水平更高
环状ecDNA扩增的转录结果发现,在所有扩增子类别中观察到DNA CN和癌基因表达水平高度显著相关(图3a)。然而,DNA CN归一化后,环状扩增子上的癌基因表达明显高于非环状扩增子。转录活性中不依赖于CN的增加现象可能部分是因为增强子劫持机制和ecDNA上染色质可及性提高。为了比较环状扩增和非环状区域之间控制基因表达的表观遗传机制,采用36个样本(ATAC-seq)图谱分析了转座酶可达染色质的重叠分析。经DNA CN水平校正后,环状和BFB扩增子的染色质明显比重排列和线性扩增子更容易接近(图3b),因此,增加的染色质可及性在ecDNA癌基因的失调中扮演了一个重要的角色。与非环状扩增相比,环状扩增的转录子融合频率增加了5倍(图3c)。我们观察到围绕环状扩增子结构的DNA CN,RNA表达和染色质可及性的聚集(图3d)。
图 3 不同类型扩增子的基因表达和染色质可及性
4. 携带ecDNA的癌症患者生存期更短
通过临床数据分析发现,与非环状或无扩增的肿瘤相比,含有ecDNA扩增的肿瘤患者的5年生存率明显更差(Fig. 4a),并且环状扩增子在恶性肿瘤如胶质母细胞瘤中更为普遍。文章通过拟合了Cox比例风险模型说明与疾病亚型相关的生存率,该模型在控制了疾病亚型后测试生存率。模型显示,携带圆形扩增子的肿瘤患者的危险比明显更高(图4b)。这些发现暗示染色体外DNA扩增与恶性肿瘤的侵袭性行为有关,可能是通过为肿瘤提供额外的途径来绕过治疗和其他进化瓶颈。
 
图 4 环型扩增子与不良预后相关
总结
本文作者通过提供的数据分析,发现环状ecDNA在癌症中发挥关键作用,环状ecDNA为实现和维持高拷贝癌基因扩增和多样性,同时驱动染色质可达性增强和癌基因转录升高。这种扩增机制在很大一部分人类癌症中起作用,并对患者预后产生负面影响,与癌症谱系无关。结果展示了ecDNA在癌症中的应用。考虑到癌症的异质性,可以肯定不同类型的癌症之间存在ecDNA结构和行为的多样性。进一步的研究将有助于更好地理解产生包括ecDNA在内的基因组重排的机制,如深入研究跨癌症的复杂结构变异的模式。本文在癌症基因组学和广泛的患者群体实用性之间建立联系,发现人类癌症中ecDNA进行诊断或治疗的潜力。
云序生物eccDNA测序
eccDNA测序(别名:Circle-Seq环状DNA测序)是eccDNA检测利器,可以高通量地对各种物种样本当中检测样品中的所有eccDNA,具有检出率高﹑准确性好等优点。云序生物eccDNA测序采用多种方法高效地富集和扩增eccDNA,简述如下:首先,利用离子交换柱高效富集基因组DNA中的eccDNA,然后利用核酸酶进一步对富集的eccDNA进行消化除去残余线性DNA。富集纯化后,通过滚环扩增获得大量的eccDNA拷贝,再利用NGS测序高通量地检测样品中所有的环状DNA分子。严谨的实验流程,极大地提高了eccDNA的检出率和检测灵敏度。最后,通过严谨的eccDNA生信流程,实现了对eccDNA准确的识别和详细的基因注释,快速找到癌症、肿瘤等疾病机理研究和诊断的靶向eccDNA。       
 
云序生物eccDNA测序实验示意图
 
云序生物eccDNA测序优势
1.国内首推eccDNA测序服务
云序生物是国内最早提供eccDNA测序服务的公司,云序在2018年已启动了eccDNA测序技术的开发。迄今为止,我们已经完成上千例样品的eccDNA测序,积累了丰富的项目经验,样品类型涵盖:组织﹑细胞﹑血清﹑血浆﹑尿液等,物种涵盖:人﹑小鼠﹑大鼠﹑拟南芥﹑果蝇﹑酵母﹑非洲爪蟾等。
云序eccDNA测序数据质控:

2.唯提供eccDNA一站式服务的公司
云序是一家提供eccDNA检测和鉴定一站式服务的公司,除了eccDNA测序,云序还可以提供包括eccDNA Outward PCR和Sanger测序在内的一系列eccDNA验证服务。
√ 云序产品1:eccDNA测序Circle-Seq
​作用:检测eccDNA最高效和准确的方法。通过柱纯化,酶切等手段对eccDNA进行纯化富集后,利用NGS测序高通量地检测和识别样品中的所有eccDNA。
√ 云序产品2:ATAC-Seq
作用:研究全基因组范围内染色质开放状态的一种高通量测序技术。ATAC-Seq数据也可用于分析处于染色质开放状态的部分eccDNA信息。
√ 云序产品3eccDNA Outward PCR验证
作用:通过核酸外切酶处理和Outward PCR验证eccDNA的环形结构。
√ 云序产品4:eccDNA Sanger测序
作用:通过金标准的Sanger测序,验证eccDNA特异性的junction位点。
3.专业的生信分析
云序生物对eccDNA进行专业细致的注释,提供eccDNA的染色体信息﹑坐标信息﹑长度信息﹑反式剪切位点信息﹑序列信息﹑对应的基因信息﹑基因的GO条目及KEGG信号通路注释信息等,为后续的研究提供了重要线索和便利。
云序eccDNA生信示例:
1)eccDNA表达和差异分析
eccDNA表达注释 (例子)
2)eccDNA整体统计
 
Venn图                              长度分布                            染色体分布
 
 
3)eccDNA功能预测
差异eccDNA的GO和KEGG信号通路分析
 
 
高质量的数据
云序生物严谨的实验流程和专业的数据分析保证了高质量的结果,eccDNA测序数据与Sanger验证结果完美吻合,实测数据示例如下:
eccDNA测序结果验证
 
2020年云序视频讲座五大主题:
1.2020年国自然热点之eccDNA研究思路解析
2.2020年国自然热点之m6A甲基化高分文章思路
3.2020年国自然热点之环状RNA研究策略及工具
4.2020年国自然热点之外泌体系统性研究方案及平台
5.2020年国自然热点之新型RNA修饰(m6A、m5C、m7G、ac4C、m1A、2’-O甲基化)研究

针对eccDNA感兴趣的老师,识别以下二维码报名,获取eccDNA的讲座视频!
 

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