文章导读
表观转录组学的研究在生物发育和疾病相关性等方面正越来越引起人们的关注。其中m6A修饰的研究是表观转录组学研究的一大热点。研究表明，m6A标签在mRNA和lncRNA中超过10,000种，并且m6A参与mRNA的转录后修饰也成为基因表达中的一种重要的调控机制。m6A的在基因表达调控方面功能作用已被广泛研究，但它在生物水平上发展的重要性仍在很大程度上不为人所知。
Nature neuroscience（IF=20.071）上一篇题目为N6-methyladenosine RNA modification regulates embryonic neural stem cell self-renewal through histone modifications的文章。本文结合m6A-seq, RNA-seq, ChIP-seq等多种技术探究了RNA甲基化修饰在调节组蛋白修饰最终影响小鼠胚胎神经干细胞的增殖与分化过程，为从表观遗传学层面调控胚胎神经干细胞发育的研究提供了新的方向。小编今天将对这篇结合了多种分子生物学研究手段的文章进行系统的解析。

发表期刊：Nature Neuroscience
影响因子：20.071
实验方法:  m6A-seq, RNA-seq, ChIP（以上服务云序均可提供）
文章链接：N6-methyladenosine RNA modification regulates embryonic neural stem cell self-renewal through histone modifications

研究内容
(1)Mettl14基因敲除降低NSC增殖并促进NSC提前分化
作者利用基因工程技术获得了正常小鼠Mettl14f/f（CK）、敲除Mettl14基因的纯合小鼠Mettl14f/f;Nestin-Cre (Mettl14-cKO)和杂合小鼠Mettl14f/+;Nestin-cre。对这三组小鼠的神经球进行体外培养，通过TLC分析不同组中的m6A水平，Mettl14-cKO中的m6A水平极低，得到进行m6A在NSC中功能研究的理想株系。作者进行了E14.5时期的体外神经元培养，检测Mettl14f/f、Mettl14f/f;Nestin-Cre 和Mettl14f/+;Nestin-cre的神经元数量与大小，检测到Mettl14-cKO中神经元的大小为对照组的55%。对NSC细胞数量的统计证明了Mettl14-cKO的NSC的增殖能力显著下降。通常细胞增殖力下降往往伴随着细胞的分化提前，作者对三个株系的NSCs进行Tuj1（神经元分化微管蛋白）染色，结果显示Mettl14-cKO NSCsTuj1+是对照组的6.2倍。这些数据说明Mettl14-cKO相比于对照组NSCs的增殖水平下降且分化提前。 接着作者在E15.5 ，E17.5小鼠的大脑皮层进行不同标记染色，Mettl14-cKO中BrdU+（检测细胞增殖的分子标记物）细胞较CK减少19%和40%；磷酸组蛋白H3 （PH3，有丝分裂标记物）的细胞减少44%和45%；Pax6+（胚胎发育中重要的调控因子）的数量减少了14%和45%。说明E15.5 ，E17.5时期Mettl14-cKO小鼠大脑皮层神经干细胞的增殖能力下降，该结果与体外结果一致。 IdU（标记正在增殖的细胞）和BrdU皮质切片双染色评估细胞周期进程，测定IdU+BrdU -的百分比（代表增殖细胞和已经离开s期的细胞）。E15.5和E17.5 Mettl14-cKO与CK相比，分别下降了38%和43%，表明Mettl14的丢失扰乱了正常的RGC细胞周期进程。E15.5和E17.5时期Mettl14-cKO小鼠的BrdU+Ki67-（标记增殖周期中的细胞）皮质切片染色信号分别减少50%和39%，说明正常RGC细胞增殖周期需要Mettl14的调节，Mettl14-cKO小鼠皮层RGC池显著减少。 为评估伴随着细胞增殖减缓，RGC在皮层中是否发生过早分化，作者用Tbr2（参与皮质细胞分化）和Neurod2 (ND2，神经系统的细胞分化)对E15.5和E17.5时期Mettl14-cKO小鼠的大脑皮层进行检测。在E15.5和E17.5时，在Mettl14-cKO小鼠大脑皮层始终可见ND2+Tbr2+细胞斑块，但在相同阶段的对照组小鼠中却不存在。以上数据说明Mettl14-cKO小鼠大脑皮层RGC池的大小减少并伴随着神经干细胞提前分化。此结果与体外NSCs的发育特征一致。 (3)Mettl14缺失导致晚期出生神经元数量减少。
在P0小鼠中，作者通过特定标记识别相应的神经元亚型，在六个不同的皮层中发现了RGCs分化的神经元。其中，Cux1在晚期出生的神经元中表达，是II-IV的标记物，对标记信号进行定量结果表明相比于CK小鼠而言Mettl14-cKO小鼠中Cux1+的信号值下降70%；Sox5是指在早期出生的神经元中表达，是V层的标记，图中结果显示Mettl14-cKO与CK之间的Sox5+信号并无显著区别；Tbr1表示在有丝分裂后的神经元中表达，是VI的标记物，结果与Sox1类似，在Mettl14-cKO中也并无显著变化。以上结果说明敲除mettl14基因之后，导致小鼠大脑皮层中晚期出生的神经元的数量下降。 (4)RNA-seq分析敲除Mettl14导致组蛋白修饰在全基因组范围内发生改变，从而影响基因表达
为了进一步明确敲除mettl14后小鼠大脑皮层出现NSCs增殖下降以及神经元细胞提前分化的分子机理，作者对Mettl14-cKO、CK和杂合小鼠株系的NSCs细胞分别进行了RNA-seq。通过对RNA-seq分析发现相比于CK和杂合株系，Mettl14-cKO中转录组表达发生显著的变化。对发生变化的基因进行GO分析预测差异表达基因的功能，结果显示上调的基因的潜在功能富集在与细胞分化相关功能，而下调的基因功能主要富集在与细胞增殖相关的基因功能。
大量研究表明，组蛋白修饰是哺乳动物细胞基因调控的关键机制，那么m6A是否能通过mRNA修饰来改变组蛋白修饰从而影响基因的表达呢？作者通过对NSCs Western Blots，评估了一组调控干细胞活性的组蛋白修饰，包括H3磷酸化，H2A和H2B泛素化，三种组蛋白乙酰化，四种组蛋白甲基化，这些组蛋白标记与基因激活或抑制有关。作者量化了western blots结果，发现H3K27ac位点在Mettl14-cKO中相比于CK增加了111%，H3K4me3位点增加了43%，H3K27me3增加了71%，说明m6A调节特异性组蛋白修饰。
为了确定这些变化是否会改变NSC的增殖，作者用抑制组蛋白修饰上调的化学抑制剂，以确定E14.5时期KO小鼠NSCs中抑制组蛋白修饰上调是否会挽救细胞增殖缺陷。其中MM102能抑制H3K4me3的形成（抑制MLL1基因）；C646能抑制H3K27乙酰转移酶Crebbp (CBP)/p300活性；GSK343抑制H3K27me3的形成（抑制Ezh2基因）。在DMSO处理后，Mettl14-cKO小鼠NSCs的数量是CK的50%，反映了预期的增殖缓慢。GSK343处理后将Mettl14-cKO与CK的比例提高，说明抑制H3K27me3的形成可以回复增殖缺陷。在C646处理后，结果一样能够回复增殖缺陷。说明m6A至少可以通过H3K27me3和H3K27ac修饰调控NSC增殖。 为了确定H3K27me3和H3K27ac修饰的目标基因，作者对Mettl14-cKO和CK小鼠的NSCs细胞进行了H3K27me3和H3K27ac的 ChIP-seq实验，通过对ChIP-seq结果与RNA-seq数据关联分析，作者选择了H3K27me3调控的5个与增殖相关的基因包括Egr2和Egr3，这些基因在Mettl14-cKO的转录组数据中相比于其在CK中的表达是显著下调的，此外也选择了H3K27ac调控的5个与分化相关的基因包括Kif26a38、Gas739和Pdgfrb40，在Mettl14-cKO的转录组数据中相比于其在CK中的表达是显著上调的。其中，H3K27me3通常标记基因启动子，与基因沉默相关，而H3K27ac富集于启动子和增强子区，与基因激活相关。那么在E14.5时期Mettl14-KO和CK的NSCs中增加H3K27me3的启动子是否与基因下调相关，而启动子/增强子H3K27ac的增加是否与基因上调相关？作者用H2K27ac抑制剂(C646)或H3K27me3抑制剂 (GSK343)处理细胞，C646处理显著降低了Mettl14-cKO小鼠NSCs中神经元分化调节因子Kif26a38、Gas739和Pdgfrb40的表达。而GSK343处理增加了转录因子Egr2和Egr3（促进细胞增殖)，说明m6A调控组蛋白修饰在NSC基因表达中的作用。上述结果表明，敲除Mettl14导致组蛋白修饰（H3K27me3和H3K27ac）在全基因组范围内发生改变，从而影响与增殖相关或分化相关的基因表达。 (5)m6A调节H3K27乙酰转移酶CBP和p300转录本的稳定性
既然Mettl14-cKO小鼠中mettl14甲基化水平下降可以影响组蛋白位点（H3K27me3和H3K27ac）的修饰，那么是否调控组蛋白H3K27me3和H3K27ac位点修饰的酶的的转录本稳定性是否受m6A调节呢？作者通过m6A-seq分别测定了H3K27乙酰化酶CBP/p300 mRNA和H3K27甲基化酶Ezh2/Eed/Suz12 mRNA上m6A修饰水平，结果发现在Mettl14-cKO中相比于CK小鼠而言，H3K27乙酰化酶CBP/p300 mRNA上有20-30%的m6A修饰位点丢失，但H3K27甲基化酶Ezh2/Eed/Suz12 mRNA上m6A修饰水平在Mettl14-cKO与CK小鼠中并没有显著差别。通过ACTD (抑制转录）处理E14.5的KO小鼠的NSCs并在3h和6h后捕获细胞来检测mRNA的稳定性，结果显示，在Mettl14-KO中相比于CK，CBP和p300的mRNA稳定性均显著增强。上述结果表明m6A可以调节H3K27乙酰转移酶CBP和p300转录本的稳定性。 技术路线 总结
本文作者通过转基因技术发现在敲除了mettl14基因的小鼠中NSC的增殖能力显著下降并且表现出分化提前的现象，随后作者通过RNA-seq分析了在Mettl14-cKO小鼠中的差异表达基因，并发现大部分与增殖相关的基因表达下调而与分化相关的基因表达上调m6A-seq发现调控H3K27ac组蛋白，随后结合H3K27me3和H3K27ac的ChIP-seq，分别找到了5个受组蛋白修饰H3K27ac调控的与分化相关的上调基因和5个H3K27me3调控的与增殖相关的下调基因，之后通过修饰酶CBP和p300受m6A甲基化调控。通过上述一系列技术手段揭示了mettl14基因敲除后小鼠胚胎神经干细胞的增殖下降和分化提前是由于m6A修饰CBP和p300的mRNA水平下降，导致CBP和p300表达上调，从而促进了H3K27乙酰化，H3K27ac又能够上调分化相关基因的表达，从而导致分化提前，而m6A修饰通过未知机制促使H3K27me3，H3K27me3能够抑制增殖相关的基因下调，从而导致增殖受阻。该文章对m6A调控NSC的自我更新进行了逻辑清晰的阐述，其中将明确的科研思路与m6A-seq, RNA-seq, ChIP-seq等技术进行了完美的结合，为我们讲述了一个完整的m6A与生物发育的故事。
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