​文章导读
如今想要短平快靠单纯测序+验证发表一篇5分左右文章，光靠一个热点环状RNA还不够，环状RNA+外泌体，环状RNA+m6A，环状RNA+环状DNA等方向都是可以去尝试的。小编今天以云序用户以环状RNA+外泌体作为研究方向的案例进行解析。
2020年6月18日云序用户山大二院在Frontiers in Oncology (IF=4.85)上发表了一篇题目RNA-Seq Profiling of Serum Exosomal Circular RNAs Reveals Circ-PNN as a Potential Biomarker for Human Colorectal Cancer的文章，该文章通过运用了云序生物外泌体全转录组测序探究了环状RNA作为结肠癌分子标志物的可能性。
结肠癌（CRC）是第三大常见恶性肿瘤，早期CRC患者存活率大大高于晚期患者，肿瘤的早期诊断对改善预后至关重要。近年来有许多研究发现，外泌体作为广泛存在于体液中的一种微囊泡，含有大量DNA、RNA和蛋白等分子，可以反应他们来源细胞的信息。许多癌细胞来源的外泌体内的分子具有成为癌症分子标志物的潜力。这其中，环状RNA由于其稳定性高，被作为多种癌症的分子标志物研究过。在这篇文章中，作者通过对50个患者和50和健康人血清中外泌体环状RNA的研究，提出了其中circ-PNN作为CRC诊断分子标志物的可能。

发表期刊：Frontiers in Oncology
影响因子：4.85
发表时间：2020.6.18
实验方法:  外泌体提取、鉴定、全转录组测序、circRNA-PCR、circRNA酶耐受、sanger测序（均由云序一站式提供）
文章链接：RNA-Seq Profiling of Serum Exosomal Circular RNAs Reveals Circ-PNN as a Potential Biomarker for Human Colorectal Cancer
研究内容
环状RNA表达谱
作者将50个CRC患者和50个正常人的血清样品分别随机分为5组均匀混样，对混样后的5v5个样品进行了外泌体全转录组测序, 检测到1924个环状RNA, 来源基因在各染色体上均有分布，环状大部分长度小于500nt。 CRC患者和健康人中环状RNA的差异表达
接着作者筛选出了122个在CRC与健康人血清外泌体中差异表达的环状RNA，其中100个显著上调，22个显著下调。其中65个为新发现的环状RNA。 差异环状RNA的功能预测
通过对环状RNA来源基因的GO分析预测差异环状RNA的功能，结果显示上调的环状的潜在功能富集在蛋白修饰和细胞对内源性刺激的反应相关功能，高尔基体相关功能和转录共激活子活性相关功能。此外KEGG分析还找到了这些基因参与的4个相关通路。 血清外泌体的鉴定
对从血清中提取的外泌体，通过电镜鉴定验证了外泌体形态，NTA分析检测了外泌体粒径大小，WB验证了外泌体标志蛋白CD9和TSG101。 Circ-PNN的生物学结构
作者通过qPCR验证了circ-PNN的差异表达，并对PCR产物进行Sanger测序验证了环状反式剪切位点的序列，并验证了发散引物仅能对环状RNA逆转录的cDNA成功扩增，而对基因组DNA扩增无效。酶耐受实验证实了circ-PNN比对应的PNN线性mRNA更稳定。 标志物circRNA分子的验证
作者扩大样本在88个CRC患者和88个健康人的血清外泌体RNA中，通过qPCR验证了circ-PNN的差异表达。通过ROC曲线分析对circ-PNN作为诊断标志物的潜力进行了研究。结果显示circ-PNN的差异表达与CRC相关，可能作为早期CRC但不是淋巴转移期的诊断标志物。 CircRNA-miRNA-mRNA网络预测和分析
最后，作者建立了circRNA-miRNA-mRNA网络，预测circ-PNN可能作用的靶基因，并通过qPCR验证了其中3个miRNA与circ-PNN的相关性。对靶基因的预测为未来研究circ-PNN影响CRC肿瘤形成提供了方向。 总结
本文作者通过外泌体全转录组测序、qPCR和Sanger测序的手段，展示了CRC中circRNA的表达谱，筛选了差异表达的circRNA，验证了其中circ-PNN的差异表达和序列，并在大量样本中验证了circ-PNN的差异表达，通过ROC分析了其作为早期CRC诊断分子标志物的可能。通过circ-PNN与miRNA共表达分析也为后续研究外泌体circ-PNN在CRC发病过程中的作用提供了线索。

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