文章导读

2018年云序客户上海交通大学医学院余健秀老师课题组在著名杂志《核酸研究》（Nucleic Acid Research）上发表文章讨论METTL3甲基化酶SUMO化对酶功能的影响，这篇优秀文章的发表也正式标志云序生物正式走入了表观转录组方向的科研助力时代。如今再传捷报！云序客户交大附属仁济医院胃肠外科赵刚老师课题组在胃癌上皮细胞间充质转化（EMT）过程中揭示RNA m6A修饰的调控作用，相关研究发表于著名杂志 Molecular Cancer，这标志着云序生物高质量RNA甲基化服务来到全盛时代！

不仅做谱，也有机制！继解析了云序客户两例甲基化谱的案例（案例一/案例二），教您如何使用甲基化数据快速发表5分文章，本周带来的重量级文章为大家分享如何做m6A甲基化机制研究。
原文链接：METTL3-mediated N6-methyladenosine modification is critical for epithelialmesenchymal transition and metastasis of gastric cancer

发表期刊：Molecular Cancer

发表日期：20191013

影响因子：10.7分

实验方法：m6A-MeRIP-seq，RNA-seq，MeRIP-qPCR，Co-IP（云序生物提供以上服务）

上皮间充质转换（EMT）过程是多种癌症细胞发生转移的重要特征，胃癌也不例外。发生EMT时，胃癌细胞逐步减少E-cadherin等细胞黏附蛋白的同时表达大量如N-cadherin、Vimentin等间充质标志蛋白。EMT和较差的临床预后紧密相关，所以理解EMT过程对于任何一种癌症的治疗都具有重要意义。之前的研究已经表明RNA甲基化修饰m6A在癌症发生发展中有调控作用，m6A甲基化酶（METTL3/METTL14/WTAP）、m6A去甲基化酶（FTO/ALKBH5）在多种疾病当中作用已经被证实，而本篇文章的结论是，METTL3是胃癌细胞EMT以及转移过程的重要促进因子，通过下游重要靶点基因METTL3对胃癌细胞的转移具有重要调控作用。

文章内容

1.METTL3的临床相关性

TCGA数据库中胃癌数据的搜索结果显示METTL3在胃癌组织中高表达且与较差的临床预后相关，这一趋势在对60例病人的qPCR验证结果中保持一致，且METTL3的表达量与分期分级呈一定相关性。重要的是，METTL3在弥散型胃癌（diffuse-type GC）样本中的表达量要高于肠型（intestinal-type GC）样本。整体水平的甲基化显示，胃癌样本中mRNA的m6A修饰水平要高于对照样本。免疫组化结果显示METTL3主要分布于细胞核。KM曲线、单因素、多因素等分析都说明METT3是一个胃癌重要的临床预后相关因子，在GC样本中高表达，并与GC的发生发展相关。

图1  METTL3高表达与临床相关性

2.METTL3是EMT过程必不可少的

免疫组化染色结果提示METTL3和N-cadherin、Vimentin表达呈正相关，与E-cadherin呈负相关。对AGS细胞系的相关检测表明，METTL3和EMT表型、间充质标志物的重要marker蛋白呈正相关。 过表达、敲除实验都能伴随着N-cadherin、Vimentin以及E-cadherin的相关性变化的同时，也能引起GC细胞整体水平m6A的变化。这些结果都表明METTL3实质上能够促进GC细胞的EMT过程发生发展。

图2 METTL3的干预可以改变EMT相关marker的改变

3.体内体外实验证明METTL3促进细胞侵袭与转移

METTL3介导的EMT过程是否能引起GC细胞的转移？划痕实验与transwell实验证明METTL3表达的下调能够明显的阻碍BGC823细胞的迁移能力与侵袭能力，而上调能够明显增强MKN-28细胞的转移能力与异位表达。尾静脉注射的裸鼠在体实验证明BGC823-shRNA细胞的转移能力要明显弱于对照细胞，反之亦然。无论体内体外实验都说明METTL3可以增强胃癌细胞的侵袭和转移能力。

图4 体内体外证明METTL3具有增强转移、侵袭能力

4. RNA-seq&m6A MeRIP-seq发现ZMYM1是METTL3的重要靶点

Mettl3的强大功能在之前的结果当中已经被证实，但是它的靶点分子有哪些？RNA-seq转录组测序首先明确在METTL3敲除以后哪些基因发生了差异性表达，测序结果显示798个基因显著下调，662个基因显著上调。相同背景的样本使用m6A MeRIP-seq甲基化测序发现9465和8794个m6A位点是组内特异的，GO分析发现差异甲基化的基因功能主要富集在半包桥小体组装（hemidesmosome assembly）、中心体定位（centrosome localization）等功能，暗示m6A修饰可能会带来染色体方面的影响。信号通路富集结果显示多个肿瘤相关的信号通路（肾癌、甲状腺癌以及HIF信号通路）都被有效富集，m6A经典motif也有显著富集。 把850个甲基化水平下调的甲基化基因和798个下调的靶基因进行联合分析把目标锁定在其中13个基因，在这13个基因当中最终选择带有两个甲基化修饰位点的ZMYM1作为下游靶标，这两个甲基化修饰位点都存在于终止密码子附近，在METTL3敲低以后甲基化水平都下调。目前，ZMYM1的生物学功能并不清楚，接下来需要做的工作就是搞清楚ZMYM1的功能以及甲基化的调控作用。

图5 差异甲基化和差异表达RNA的联合分析

5. ZYMY1与METTL3相关性探索

无论在蛋白水平还是RNA水平，METTL3的敲除的可以显著下调ZMYM1的表达，而METTL3的过表达可以上调ZMYM1表达，实验证明ZMYM1和METTL3呈正相关，METTL3正相关调控ZMYM1。

图5 METTL3和ZYMY1相关性分析

6. METTL3通过依赖于HuR结合增强ZMYM1 mRNA稳定性

MeRIP-qPCR首先用于对ZMYM1 mRNA甲基化区域的验证。在确定了ZMYM1 mRNA的甲基化位点确实存在之后，通过METTL3的过表达或敲除之后能够明显改变该位点的甲基化水平，进一步说明该m6A位点受METTL3的调控。通过对ZMYM1甲基化位点的单碱基突变，过表达或者敲除METTL3对该甲基化位点的调控作用就消失了。由于HuR蛋白和METTL3一样主要分布在细胞核当中，并且一直被认为是一个由METTL3募集的间接m6A Reader蛋白，作者选择重点关注HuR和RNA分子之间的相互结合，HuR和ZYMY1的结合区域恰巧在m6A修饰位点附近，在ZMYM1发生去甲基化（沉默METTL3）以后，HuR和METTL3的结合大大减弱，这一系列实验证明METTL3对ZMYM1的影响是通过m6a修饰从而结合HuR蛋白来进行的。

图6 甲基化位点的碱基突变策略以及影响HuR蛋白相互结合

7. ZMYM1复合物在核内抑制E-cadherin从而影响EMT过程

由于锌指蛋白结构有调控转录活性特性的特点，猜想ZMYM1同样在细胞核内有调控转录活性的作用。实验证明ZMYM1能够通过MYM型锌指结构同CtBP/LSD1/CoREST复合物结合，进而增强对靶基因的转录抑制作用。免疫共沉淀Co-IP实验证实了ZYMY1与CtBP/LSD1/CoREST复合物结合的存在形式。而这种复合物的存在可以有效的靶向抑制E-cadherin的转录。直接对ZMYM1的过表达或者敲除实验也证明ZMYM1能够改变胃癌细胞的迁移与侵袭行为，METTL3正是通过调控m6A影响HuR蛋白结合的方式来改变METTL3的表达量，进而促进胃癌细胞的EMT过程。

总结

RNA甲基化作为当下生命科学的研究领域最热主题被广泛研究，在多种疾病当中均有显著调控作用，花样繁多的作用方式可以从RNA分子核内转录到核外成熟从而影响其分子一生。这项研究成果让读者从新的角度来解释甲基化对肿瘤EMT的影响。2019年对于云序生物来说是丰收的一年，云序生物成熟的RNA甲基化测序服务平台帮助多位客户成功申请国自然，发表高分文章。对于这个全新且火热的领域，云序生物高通量产品已经成为广大科研工作者的选择，找差异，找位点，广撒网，定方案。云序生物将再接再厉，助力多位客户发表高分文章，欢迎各位来电垂询！

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实验流程

m6A MeRIP测序流程图 

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