circRNA和m6A再次秀恩爱携手登上Nature Communication
发布时间：2020-01-12 10:48 | 点击次数：
以m6A为代表的RNA修饰是近几年的热点研究方向，目前已有多篇文章报道多种RNA分子都可携带m6A的修饰。推荐往期阅读：
m6A后宫佳丽竟然如此众多，不会独宠于一人。有趣的是不管是昨日明星miRNA分子还是今日明星之子circRNA，都能够被m6A宠幸。而且过期网红miRNA被m6A宠幸后重新焕发昔日耀眼的光芒，直接威胁到今日明星之子circRNA正宫之主的地位。今天小编带领大家看看m6A是如何携手circRNA通过环状RNA高通量技术和MeRIP技术联合分析秀出新高度。
2019年10月16日，circRNA m6A修饰一文发表在Nature Communication（IF=11.878）杂志上。报道发现m6A修饰的circNSUN2可结合YTHDC1并促进出核，进一步结合IGF2BP2促进HMGA2 mRNA的稳定，最终促进结直肠癌的肝转移增强。这一成果来自于中山大学附属肿瘤医院的谢丹教授，徐瑞华教授和Wang Fengwei。本文通过环状RNA高通量技术研究结直肠癌circRNA表达谱，以及结直肠癌肝转移样本分析发现circNSUN2的表达明显增高，体内实验证明circNSUN2与CRC的肝转移相关。利用RNA pull-down实验找到circNSUN2结合蛋白YTHDC1和IGF2BP2，并通过MeRIP-PCR实验证实circNSUN2存在m6A修饰，最后通过RNA测序分析出circNSUN2的靶基因HMGM2，并利用RIP实验证实IGF2BP2与HMGM2结合受circNSUN2调控。本文研究结果表明m6A修饰可调控circRNA的出核，是circRNA修饰研究的重要进展，为circRNA修饰研究提供新的方向。
m6A修饰的circNSUN2调控其出核和HMGA2稳定并促进结直肠肠癌的肝转移
发表期刊：Nature Communication
影响因子：11.878
实验方法：高通量测序技术，MeRIP-qPCR，RNA pull down，RIP等。（以上实验云序均可提供）
实验样本：人结直肠组织vs结直肠癌组织
文章技术路线
红色标记部分：云序生物可提供服务
1. 如何筛选出circNSUN2分子的？
本文作者通过 高通量筛选技术（云序提供此项服务）分析两对结直肠癌（CRC）与癌旁组织样本circRNA表达谱，共找到13167个circRNA分子。基因组拷贝数畸变（CNV）是肿瘤发生重要的驱动因素，作者猜测该区域的circRNA与肿瘤的发生发展有关联，于是选择CRC中最常见的CNV位点，鉴定出对应位点异常表达有38种circRNA，其中9种circRNA的变化趋势在两例肿瘤标本中是一致的。为进一步分析筛选对结直肠癌更有临床意义的分子，作者在97例CRC的标本库中分析了这9个circRNA的表达情况，其中4种circRNA在超过75%的标本中呈现出高表达的趋势。在97例标本群体中，circNSUN2高表达的组生存状况显著低于低表达组，研究结果表明circNSUN2不仅在CRC患者体内高表达也在结直肠癌肝转移患者体内呈现明显上调趋势，显然circNSUN2在结直肠的发生发展中起着重要的作用。
图1. circNSUN2的筛选
2. circNSUN2的鉴定
作者利用Sanger测序、RNase R酶消化（云序生物提供此项服务）、放线菌D处理稳定性分析、亚细胞定位和FISH等实验分别从序列、结构、表达、定位对circNSUN2进行验证和鉴定，发现circNSUN2主要位于细胞质中。
图2. circNSUN2的鉴定
3. circNSUN2在CRC中功能验证
在TC17细胞或PDX模型的细胞中敲低或过表达circNSUN2，分析circNSUN2对肝转移效率的影响情况。实验结果均表明干扰circNSUN2可以降低CRC的肝转移而过表达circNSUN2则促进肝转移，circNSUN2在CRC的肝转移过程中发挥重要作用。
4. circNSUN2在CRC中功能机制探讨
一般探讨circRNA机制最先想到的是经典的海绵机制，然而海绵机制又是老生常谈，所以作者选择circRNA可能结合蛋白参与CRC调控更具有价值意义。这里就是利用分子机制研究中常用到的RNA pull-down技术（云序生物提供此项服务）,分析circNSUN2结合的蛋白，经过质谱分析发现了YTHDC1和IGF2BP2，而且western blot和RIP实验（云序生物提供此项服务）都证实circNSUN2与YTHDC1、IGF2BP2的相互作用。有趣的是YTHDC1是已知的m6A修饰Reader分子之一，而IGF2BP2是一种RNA结合蛋白，与mRNA的稳定性有关，已知在CRC中与侵袭有关。那这就耐人寻味了，circNSUN2是否也存在着m6A修饰或参与mRNA的稳态呢？作者这里分别探讨circNSUN2与这两种蛋白的作用机制。
1）YTHDC1是否参与circNSUN2的m6A修饰？
作者通过MeRIP-PCR实验（云序生物提供此项服务）证明了circNSUN2确实可以被m6A的抗体富集，这也就意味circNSUN2分子上存在m6A修饰位点。而motif分析、点突变实验进一步证实了m6A修饰介导了circNSUN2与YTHDC1的相互作用。这种m6A修饰是否也是驱动circRNA翻译的呢？根据circNSUN2结合蛋白来看不是那么简单的作用，作者猜测这种修饰会影响其在亚细胞中的分布？果然FISH和YTHDC1敲低实验都证实这一点，敲除YTHDC1后核内circNSUN2的丰度明显增高了，显然YTHDC1参与circNSUN2的m6A修饰并促进其出核。
图3. YTHDC1介导circNSUN2的m6A修饰促进其出核
2）IGF2BP2与circNSUN2的结合
作者通过RNA pull-down和RIP实验都证实circNSUN2与IGF2BP2的结合，为了进一步分析它们的结合，作者通过已经报道IGF2BP2结合RNA的motif分析，发现circNSUN2中也存在这样的基序，而基序位点突变分析更加确定了circNSUN2与IGF2BP2的结合。
图4. circNSUN2上motif分析
3）如何寻找circNSUN2调控的靶基因呢？
既然IGF2BP2与mRNA的稳定性有关，那么circNSUN2与IGF2BP2结合是否也会影响一些mRNA的稳定性？为了找到circNSUN2下游靶基因，作者再次利用mRNA测序（云序生物提供此项服务），敲除circNSUN2后发现有644个mRNA发生明显的差异表达。而且已知IGF2BP2通常结合mRNA 的3’UTR区富含AU的序列，利用这一点，进一步筛选出21个mRNA可以结合IGF2BP2，而且q-PCR发现在CRC肝转移患者内HMHA2是异常高表达。RNA pull-down 、荧光素酶实验、免疫荧光-FISH共定位等实验分析进一步证实了circNSUN2/ YTHDC1/IGF2BP2复合体与HMGA2 mRNA的结合，可见circNSUN2调控的靶基因是HMHA2。
图5.circNSUN2/ YTHDC1/IGF2BP2复合体与HMGA2的结合
4) HMHA2功能验证
最后，作者在小鼠体内模型中验证了上述分子模型与CRC肝转移的相关性。实验结果表明单独干扰circNSUN2可抑制肝转移，但如果同时过表达HMGA2则促进肝转移。
图6. HMGA2是circNSUN2调控CRC肝转移的介导者
总结：
在小编看来，本文的亮点是作者巧妙的利用RNA测序、RIP技术、RNA pulldown技术和MeRIP技术关联分析揭示了circRNA m6A修饰的功能机制，RNA甲基化和明星之子circRNA强强联手出新高度。那么本篇文章在通过高通量筛选出目的环状RNA之后，经过多次实验一步步证明环状RNA存在m6A修饰，中间历经了九九八十一难，小编在此基础之上，为大家推荐了快速找到发生m6A修饰的环状RNA的方式。云序生物的全转录组测序联合m6A测序，可以快速找到发生m6A修饰的环状RNA、lncRNA、mRNA，快速牟定了发生m6A修饰的关键靶基因，一步到位。无论您关心哪种RNA分子的m6A修饰，云序生物m6A-全转录组都将一网捕获。
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