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云序客户13分顶级文章，揭示糖尿病血小板来源miRNA参与海绵机制介导动脉损伤修复
发布时间：2019-04-03 10:24 | 点击次数：
文章导读
血管平滑肌细胞（VSMC）在健康状态下处于去分化表型，在其受损时，循环系统中的血小板快速激活，通过凝血反应为受伤部位止血，同时对创伤部位释放PDGF、血栓烷等生物活性介质，使VSMC切换为高分化表型，同时细胞处于促增殖状态。血管内膜增生型糖尿病就是由于VSMC分化和去分化状态切换机制失调引起的。然而，这类疾病的分子机制还不清楚。
血管平滑肌细胞（VSMC）在健康状态下处于去分化表型，在其受损时，循环系统中的血小板快速激活，通过凝血反应为受伤部位止血，同时对创伤部位释放PDGF、血栓烷等生物活性介质，使VSMC切换为高分化表型，同时细胞处于促增殖状态。血管内膜增生型糖尿病就是由于VSMC分化和去分化状态切换机制失调引起的。然而，这类疾病的分子机制还不清楚。
云序生物携手广州市妇女儿童医疗中心科研团队首次揭示血小板中miR-223通过调控靶基因表达从而介导创伤修复过程，同时建立了糖尿病分子机制模型，为日后细胞损伤修复过程提供了参考依据。
发表期刊：Journal of Clinical Investigation
影响因子：13.3
实验方法：AGO2 RIP实验，miRNA测序
实验材料：VSMC与血小板共培养组（实验组），VSMC未处理组（空白组）；模型小鼠等
影响因子：13.3
实验方法：AGO2 RIP实验，miRNA测序
实验材料：VSMC与血小板共培养组（实验组），VSMC未处理组（空白组）；模型小鼠等
研究内容
1.活化血小板促进人类VSMC分化增殖
首先，本篇文章作者以人类VSMC与活化血小板共培养的细胞为实验组（AP），未做处理的细胞为空白对照组（RP），进行qPCR和WB检测，结果显示共培养组细胞内与分化相关的marker显著表达，同时细胞增殖能力减弱，这与常理相反。接着，作者从体外和体内角度分别借助共聚焦显微镜观测到VSMC能够分泌血小板。那么问题来了，血小板是否会携带其他分子动态的参与到分化过程呢？
首先，本篇文章作者以人类VSMC与活化血小板共培养的细胞为实验组（AP），未做处理的细胞为空白对照组（RP），进行qPCR和WB检测，结果显示共培养组细胞内与分化相关的marker显著表达，同时细胞增殖能力减弱，这与常理相反。接着，作者从体外和体内角度分别借助共聚焦显微镜观测到VSMC能够分泌血小板。那么问题来了，血小板是否会携带其他分子动态的参与到分化过程呢？
图1. 分化相关蛋白WB结果；共聚焦显微镜观测VSMC能够自主分泌血小板
2.血小板携带miRNA进入VSMC并参与分化过程
带着前面的问题，作者通过查阅文献，了解到前人曾经报道过血小板中富含大量的miRNA。那是否是由于血小板中的miRNA参与了细胞的分化呢？接下来的实验就变的简单了，借助高通量miRNA测序手段（云序生物miRNA测序服务）对比共培养细胞和未处理组细胞中差异表达的miRNA。测序结果检测到3个与研究显著相关的miRNA：分别为miR-223和miR-143/145。借助miRNA定量PCR验证，发现三者都在共培养细胞中高表达，其中miR-223在共培养8h时高表达，miR-143/145在共培养24h时高表达。那知道了这三者在时间轴上的表达模式，它们发挥了什么样的机制呢？于是，作者借助AGO2 RIP实验（云序生物提供此项服务）在实验组中拉取与AGO2蛋白直接结合的miRNA，通过miRNA 定量PCR，证实以上三个miRNA能够直接与AGO2蛋白结合，参与了海绵机制，并且也证实血小板分泌的miRNA的确是起活性的。
带着前面的问题，作者通过查阅文献，了解到前人曾经报道过血小板中富含大量的miRNA。那是否是由于血小板中的miRNA参与了细胞的分化呢？接下来的实验就变的简单了，借助高通量miRNA测序手段（云序生物miRNA测序服务）对比共培养细胞和未处理组细胞中差异表达的miRNA。测序结果检测到3个与研究显著相关的miRNA：分别为miR-223和miR-143/145。借助miRNA定量PCR验证，发现三者都在共培养细胞中高表达，其中miR-223在共培养8h时高表达，miR-143/145在共培养24h时高表达。那知道了这三者在时间轴上的表达模式，它们发挥了什么样的机制呢？于是，作者借助AGO2 RIP实验（云序生物提供此项服务）在实验组中拉取与AGO2蛋白直接结合的miRNA，通过miRNA 定量PCR，证实以上三个miRNA能够直接与AGO2蛋白结合，参与了海绵机制，并且也证实血小板分泌的miRNA的确是起活性的。
图2. miRNA高通量测序聚类图；
miRNA定量PCR表明三者在共培养细胞中差异高表达
miRNA定量PCR表明三者在共培养细胞中差异高表达
图3. AGO2 RIP-miRNA 定量PCR证实以上三个miRNA参与了海绵机制
3.miR-223的靶基因为PDGFRβ
通过生信分析，预测与miRNA结合力最强的靶基因：KLF4，KLF5和PDGFRβ。当然，前面都是推测，作者通过荧光素酶实验证实两者是直接结合关系。接下来，作者主要研究了miR-223和PDGFRβ的关系。对靶基因PDGFRβ进行定量PCR后，发现其在受伤股动脉中高表达，证明创伤能使其表达量发生变化。并且，与miR-223表达量成反比。综上，说明PDGFRβ的确是miR-223靶基因。
图4. 生信分析预测miRNA和靶基因（3’UTR区）结合
图5. 荧光定量证实miRNA和靶基因的表达量呈负相关
4.miR-223在糖尿病小鼠中低表达并促进血管内膜增生
VSMC分化失常主要会使人患上血管增生型糖尿病，因此作者希望通过分子手段研究miR-223在糖尿病中发挥的机制。miRNA定量PCR结果显示，miR-223不管在人还是小鼠的糖尿病组中都是低表达的模式。那miR-223在细胞中的定位是如何的呢？通过荧光原位杂交，作者发现糖尿病患者的血小板也被内化到VSMC中。因此推测，血小板内化至细胞后，引起血小板内部miR-223的低表达，从而促进了miRNA靶基因在体内的高表达，最终导致血管平滑肌细胞增殖和内膜增生的表型。
图5. 荧光定量证实miRNA不管在人源还是鼠源都在糖尿病组中低表达；与靶基因的表达成反比；
miRNA低表达促进糖尿病患者血管内膜增生
5.构建VSMC损伤修复模型
作者首次提出VSMC损伤修复机制模型，机制的参与成员主要包括VSMC、内皮组织和血小板，如下图所示。在未受伤个体中，内皮组织完整，VSMC和血小板间无相互作用。当受损时，内皮屏障受损，血小板活化，一方面释放PDGF，TXA2等物质，另一方面携带miRNA进入VSMC中，提高靶基因的表达，从而促进细胞分化，抑制血管内膜增生。但当糖尿病患者受损伤时，血小板在释放促修复物质方面与前者一致，但在分子机制上与普通损伤机制上截然相反。
作者首次提出VSMC损伤修复机制模型，机制的参与成员主要包括VSMC、内皮组织和血小板，如下图所示。在未受伤个体中，内皮组织完整，VSMC和血小板间无相互作用。当受损时，内皮屏障受损，血小板活化，一方面释放PDGF，TXA2等物质，另一方面携带miRNA进入VSMC中，提高靶基因的表达，从而促进细胞分化，抑制血管内膜增生。但当糖尿病患者受损伤时，血小板在释放促修复物质方面与前者一致，但在分子机制上与普通损伤机制上截然相反。
图6. 正常和糖尿病组中血小板通过运输miRNA参与VSMC功能
总结：
本篇文章作者首先将血小板和VSMC共培养，发现细胞分化情况与常理相反的现象。由此推测血小板中的miRNA在起作用。推断依据是：1. 观测到血小板是由VSMC内化而来。2. 前人研究发现血小板中含有大量miRNA，为证实推测结果，作者通过miRNA高通量测序技术快速找出可能起作用的miR-223，并通过AGO2 RIP实验证实miR-223参与了海绵机制。借助生信预测，验证和荧光素酶实验，找出了靶基因PDGFRβ。最后，推测出VSMC损伤修复的模型以及糖尿病模型中，作者发现了相反的机制，为今后临床研究带来了巨大的帮助。云序优势总结
优势总结：
值得一提的是，云序生物不仅仅为广大科研用户解决测序问题，更提供了机制解决手段。迄今为止，完成RIP和RNA pull down实验达到100+案例，助力广大科研工作者冲刺高分文章。
本篇文章作者首先将血小板和VSMC共培养，发现细胞分化情况与常理相反的现象。由此推测血小板中的miRNA在起作用。推断依据是：1. 观测到血小板是由VSMC内化而来。2. 前人研究发现血小板中含有大量miRNA，为证实推测结果，作者通过miRNA高通量测序技术快速找出可能起作用的miR-223，并通过AGO2 RIP实验证实miR-223参与了海绵机制。借助生信预测，验证和荧光素酶实验，找出了靶基因PDGFRβ。最后，推测出VSMC损伤修复的模型以及糖尿病模型中，作者发现了相反的机制，为今后临床研究带来了巨大的帮助。云序优势总结
优势总结：
值得一提的是，云序生物不仅仅为广大科研用户解决测序问题，更提供了机制解决手段。迄今为止，完成RIP和RNA pull down实验达到100+案例，助力广大科研工作者冲刺高分文章。
云序客户发表RIP & RNA pull down文章：
1、The RNA binding protein SORBS2 suppresses metastatic colonizatio of ovarian cancer by stabilizing tumorsuppressive immunomodulatory transcript
2、Upregulation of the long noncoding RNA FOXD2-AS1 promotes carcinogenesis by epigenetically silencing EphB3 through EZH2 and LSD1, and predicts poor prognosis in gastric cancer
3、Circular RNA alterations are involved in resistance to avian leucosis virus subgroup-J-induced tumor formation in chickens
全文链接：
https://doi.org/10.1172/JCI124508
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上海云序生物科技有限公司
Shanghai Cloud-seq Biotech Co., Ltd.
地址：上海市松江区莘砖公路518号20号楼3楼
电话：021-64878766
传真：021-64878766
网址：www.cloud-seq.com.cn
邮箱：market@cloud-seq.com.cn
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