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占领 C 位！云序生物解析如何做到快速同时检测各类癌症当中 RNA 甲基化相关酶＆RNA 甲基化水平（下）
发布时间：2019-05-21 14:33 | 点击次数：
又到了一周云序生物课堂开讲时间！你，准备好了吗？
上一期文章当中，云序通过引用这样一张表格给大家传递了一个重要信息：表中的 METLL3、METTL14、NSun2、FTO、ALKBH5、YTHDF2 均是 RNA 甲基化重要的酶，而且这些酶在不同疾病当中意义有所不同，例如 METTL3 在 AML、BC、HCC 当中都是原癌基因，而到了 GBM 当中竟然变成了抑癌基因；同样是甲基化酶，在 HCC 当中，METTL3 是原癌基因而 METTL14是抑癌基因。不管怎样这些酶都在疾病当中扮演重要角色，对疾病细胞的侵袭、增殖能力都有所影响，那么如何做到围绕一个酶把故事的来龙去脉讲清楚呢？
RNA 甲基化从酶入手，高分文章立刻拥有，截至目前，RNA 甲基化相关领域的研究仍在起步阶段，但围绕甲基化酶研究的思路已经是高分文章的策略。云序生物课堂，今天就想跟大家聊聊，如何从酶入手打造高分 RNA 甲基化文章：
1. 确定相应疾病背景下的酶
RNA 甲基化相关的酶包括甲基化酶、去甲基化酶、识别蛋白三大类，到底选哪一个酶来做？良好的开端是成功的一半，哪个酶最值得研究成了首要问题。
RNA 甲基化相关的酶包括甲基化酶、去甲基化酶、识别蛋白三大类，到底选哪一个酶来做？良好的开端是成功的一半，哪个酶最值得研究成了首要问题。
RNA-seq 检测相关酶的表达量改变
（DOI: 10.1111/acel.12753）
（DOI: 10.1111/acel.12753）
倍数表达变化改变总结
（DOI: 10.1002/hep.29683）
（DOI: 10.1002/hep.29683）
1）云序生物推荐 mRNA 测序结合 qPCR 的方式检测酶变化
mRNA 测序能给出疾病模型或疾病样本中异常表达的所有基因，其中包括 RNA 甲基化相关的 METTL14、METTL3、FTO 和 ALKBH5 等重要的酶在 RNA 水平上的变化检测。在设置生物学重复的前体下优先选择倍数表达变化高的并且p值较小的酶作为潜在的研究靶点。qPCR 技术可以对选择的靶点酶进行扩大样本量验证用于确定该酶的异常表达。
mRNA 测序能给出疾病模型或疾病样本中异常表达的所有基因，其中包括 RNA 甲基化相关的 METTL14、METTL3、FTO 和 ALKBH5 等重要的酶在 RNA 水平上的变化检测。在设置生物学重复的前体下优先选择倍数表达变化高的并且p值较小的酶作为潜在的研究靶点。qPCR 技术可以对选择的靶点酶进行扩大样本量验证用于确定该酶的异常表达。
相关酶的WB蛋白检测
（https://doi.org/10.1038/s41590-018-0275-z）
（https://doi.org/10.1038/s41590-018-0275-z）
2）蛋白检测
不仅局限于 RNA 水平，云序推荐结合 Western Blot 技术检测酶在蛋白水平上的变化，如果在 RNA 水平和蛋白水平都提供有力的证据证明酶表达量改变，则为接下来的实验奠定了坚实的基础。
不仅局限于 RNA 水平，云序推荐结合 Western Blot 技术检测酶在蛋白水平上的变化，如果在 RNA 水平和蛋白水平都提供有力的证据证明酶表达量改变，则为接下来的实验奠定了坚实的基础。
大样本 qPCR 验证 ALKBH5 高表达与较差临床预后有关
（http://dx.doi.org/10.1016/j.ccell.2017.02.01）
（http://dx.doi.org/10.1016/j.ccell.2017.02.01）
3）数据挖掘
对于常见疾病，如癌症，现有的数据库已经有了相当丰富的疾病表达数据以及临床诊断和预后相关分析，友好的网页界面方便用户简单点击鼠标就可以快速知道疾病相关的表达图谱，这当然一定包含这些酶的信息。漂亮的生存曲线轻松绘制，临床效果显著相关的信息对于靶点的选择又是一剂强心剂。
综上，评价一个酶是否可以作为靶点进行研究主要看三方面，RNA表达改变（变化倍数和p值）、蛋白表达改变和临床意义。
对于常见疾病，如癌症，现有的数据库已经有了相当丰富的疾病表达数据以及临床诊断和预后相关分析，友好的网页界面方便用户简单点击鼠标就可以快速知道疾病相关的表达图谱，这当然一定包含这些酶的信息。漂亮的生存曲线轻松绘制，临床效果显著相关的信息对于靶点的选择又是一剂强心剂。
综上，评价一个酶是否可以作为靶点进行研究主要看三方面，RNA表达改变（变化倍数和p值）、蛋白表达改变和临床意义。
2. 实验室中复盘酶的重要生物学作用
ALKBH5对细胞增殖的影响
（http://dx.doi.org/10.1016/j.ccell.2017.02.01）
（http://dx.doi.org/10.1016/j.ccell.2017.02.01）
METTL3促进肿瘤生长
（https://doi.org/10.1002/hep.29683）
（https://doi.org/10.1002/hep.29683）
1）最直接的方式就是对该酶进行过表达或敲除实验并观察细胞表型是否有改变
对于表型的定义针对不同类型的疾病模型有所区别，肿瘤细胞的细胞表型就是我们所熟知的细胞侵袭、增殖等。另外，裸鼠成瘤实验是证实甲基化酶调控细胞成瘤过程最直接手段。
对于表型的定义针对不同类型的疾病模型有所区别，肿瘤细胞的细胞表型就是我们所熟知的细胞侵袭、增殖等。另外，裸鼠成瘤实验是证实甲基化酶调控细胞成瘤过程最直接手段。
整体水平RNA m6A比色法检测（Elisa试剂盒）
（DOI: 10.1002/hep.29683）
（DOI: 10.1002/hep.29683）
2）整体水平评价甲基化水平改变
甲基化酶或者去甲基化酶的过表达与敲除理论上会造成甲基化水平的广谱改变，此时可以使用商业化的比色法试剂盒来说明酶的人工干预对甲基化水平产生了影响。
甲基化酶或者去甲基化酶的过表达与敲除理论上会造成甲基化水平的广谱改变，此时可以使用商业化的比色法试剂盒来说明酶的人工干预对甲基化水平产生了影响。
3. 多组学联合运用找靶点：转录组测序甲基化测序，双剑合璧
多个表达谱数据取交集找到靶基因
（DOI: 10.1002/hep.29683）
（DOI: 10.1002/hep.29683）
甲基化数据同表达谱数据取交集
（http://dx.doi.org/10.1016/j.ccell.2017.02.01）
（http://dx.doi.org/10.1016/j.ccell.2017.02.01）
1）云序生物推荐 MeRIP-seq 测序技术对干预和未干预的生物学样品进行 m6A 甲基化测序，测序结果中会呈现甲基化位点的具体位置和差异甲基化位点的位置。测序结果当中会呈现超甲基化、去甲基化、高表达、低表达的相关基因，而建立这一关系的理论依据是甲基化水平的改变会造成 RNA 水平的改变。目前 RNA 甲基化使 RNA 水平下降是广泛接受的结论，影响方式可以通过降低 RNA 分子同 HuR 结合蛋白的结合力而使稳定性下降，也可以通过 YTHDF 家族蛋白识别并降解 RNA 的途径使 RNA 水平减少。是否有 RNA 甲基化能促进 RNA 的表达水平？目前还尚没有定论。
4. 灵活展示酶与下游靶基因的关系以及其他功能实验
确定了酶和酶潜在靶基因间的关系。通过整合多篇高分文章的内容，为大家梳理一下思路。
确定了酶和酶潜在靶基因间的关系。通过整合多篇高分文章的内容，为大家梳理一下思路。
IGV 软件上观测到靶基因上存在 4 处 RNA 甲基化的区域
（http://dx.doi.org/10.1016/j.ccell.2017.02.01）
（http://dx.doi.org/10.1016/j.ccell.2017.02.01）
1）验证靶基因的甲基化，mRNA 和蛋白表达情况
任何高通量测序的结果都需要通过低通量的验证，通过 MeRIP-qPCR，qRT-PCR 和 WB 分别验证靶基因的甲基化和表达量情况。其中，若靶基因 mRNA 的表达量不改变，也不用太担心，因为甲基化修饰可能改变了该基因的蛋白翻译效率，做个 WB 试试。
任何高通量测序的结果都需要通过低通量的验证，通过 MeRIP-qPCR，qRT-PCR 和 WB 分别验证靶基因的甲基化和表达量情况。其中，若靶基因 mRNA 的表达量不改变，也不用太担心，因为甲基化修饰可能改变了该基因的蛋白翻译效率，做个 WB 试试。
RIP 实验证实 ALKBH5 酶与靶基因直接结合
（DOI: 10.1002/hep.29683）
（DOI: 10.1002/hep.29683）
RNA Pull Down 实验证实靶基因能与 ALKBH5 蛋白直接结合
（DOI: 10.1002/hep.29683）
2）RNA 甲基化酶是否和靶点基因的 mRNA 直接结合
通过RIP实验，特异性借助 RNA 甲基化酶抗体拉取样本中与其直接结合的 RNA，再通过 qRT-PCR 手段，检测靶基因是否存在于拉取的复合物中，从而决定性的证实甲基化酶与靶基因是直接结合的。相反的，RNA Pull Down 实验，借助根据靶基因合成的探针，特异性拉取与其结合的蛋白，通过 WB 手段，检测甲基化酶是否存在于拉取的复合物中。这样一来一往，就能明确两者是直接结合的。
通过RIP实验，特异性借助 RNA 甲基化酶抗体拉取样本中与其直接结合的 RNA，再通过 qRT-PCR 手段，检测靶基因是否存在于拉取的复合物中，从而决定性的证实甲基化酶与靶基因是直接结合的。相反的，RNA Pull Down 实验，借助根据靶基因合成的探针，特异性拉取与其结合的蛋白，通过 WB 手段，检测甲基化酶是否存在于拉取的复合物中。这样一来一往，就能明确两者是直接结合的。
3）解释酶对甲基化靶基因影响的工作原理
从酶入手研究 RNA 甲基化策略是这类高分文章的主流，上游的酶，下游的靶基因，建立联系一气呵成，根本上解释了甲基化酶、去甲基化酶以及识别蛋白通过靶基因对疾病的调控作用。云序生物提炼的这一思路适用于大部分疾病的 RNA 甲基化研究探索，RNA 甲基化研究这么热，这么新，为什么不尝试用这种方式解释您关心的疾病、表型变化中甲基化所起到的作用呢？欢迎广大老师来电咨询云序技术团队，云序竭诚为您服务。
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