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Nat. commun | Mettl3介导的m6A RNA甲基化调控骨髓间充质干细胞和骨质疏松症的命运
发布时间：2018-12-05 16:05 | 点击次数：
文章导读：
近日，四川大学华西医院的周学东和袁泉研究组，联合中山大学第一附属医院的林水宾团队合作研究共同揭示了Mettl3介导m6A RNA甲基化调控骨髓间充质干细胞和骨质疏松症命运的新机制。该研究成果以Mettl3-mediated m6A RNA methylation regulates the fate of bone marrow mesenchymal stem cells and osteoporosis为题，于11月14日在《Nature communications》(IF:12.353)杂志在线发表。
研究思路
研究团队首先利用CRISPR-Cas9技术构建了MSCs有条件的敲除和敲入Mettl3的模型小鼠，然后微型CT和染色显示敲除后导致低骨量和高骨髓脂肪，并且MSCs中m6A整体甲基化水平也有所降低；同时，与执行了卵巢切除术的模型鼠相比，Mettl3过表达可预防雌激素不足引起的骨质疏松；接下来通过m6A MeRIP-seq和RNA-seq技术发现Mettl3缺失的MSCs存在PTH调控基因表达的全局下调，提示PTH/Pth1r信号轴可能是Mettl3介导的m6A甲基化对MSCs命运的影响通路。PTH间歇性注射实验也是印证了m6A通过调节PTH/Pth1r信号轴影响MSCs的成骨和脂肪分化的结论。另外，Pth1r的过表达可以在很大程度上逆转MSCs向脂肪细胞的倾斜分化，改善成骨，进一步证实了PTH/Pth1r信号通路是mettl3介导的m6A修饰控制MSCs谱系分配的新机制。
研究内容
1. MSCs 中Mettl3的敲除可导致低骨量、高骨髓脂肪
利用CRISPR-Cas9技术构建了MSCs有条件的敲除Mettl3的模型小鼠，股骨石蜡切片免疫染色和WB验证了Mettl3的敲除是的成功的。结果显示Mettl3敲除小鼠与对照组相比，骨质量损失且骨髓脂肪组织积聚显著，其骨骼特征与骨质疏松症的病理表型相似。同时LC-MS/MS检测发现MSCs中m6A甲基化整体水平下降。
2. MSCs中Mettl3的缺失导致成骨潜能降低和脂肪分化增加
接下来，从Mettl3敲除的小鼠中分离出MSCs以验证其体外成骨和成脂潜能。碱性磷酸酶染色活性减弱，钙化减少，并且成骨标志物Runx2, Sp7, Alp和 Bglap 表达下调，表明缺失的MSCs成骨能力不强。相反，油红O染色强度的增加和显著的高表达是脂肪形成的潜在因素，包括Pparγ, Cebpα, Adipoq, Plin1和 CD36。
接下来，从Mettl3敲除的小鼠中分离出MSCs以验证其体外成骨和成脂潜能。碱性磷酸酶染色活性减弱，钙化减少，并且成骨标志物Runx2, Sp7, Alp和 Bglap 表达下调，表明缺失的MSCs成骨能力不强。相反，油红O染色强度的增加和显著的高表达是脂肪形成的潜在因素，包括Pparγ, Cebpα, Adipoq, Plin1和 CD36。
3. Mettl3过表达可预防雌激素不足引起的骨质疏松
为了印证Mettl3过表达是否能够增强骨骼健康或预防骨骼疾病，在这里构建了MSCs中有条件的敲入Mettl3，使其在MSCs中过表达。通过卵巢切除术建立骨质疏松症实验模型，与对照相比Mettl3过表达增加了卵巢切除术后小鼠成骨细胞数量，但不影响破骨细胞活性。H&E染色和组织形态学分析显示，去卵巢的对照组小鼠骨髓脂肪细胞过度积累，而去卵巢的Mettl3敲入小鼠骨髓脂肪细胞的增加较小。
为了印证Mettl3过表达是否能够增强骨骼健康或预防骨骼疾病，在这里构建了MSCs中有条件的敲入Mettl3，使其在MSCs中过表达。通过卵巢切除术建立骨质疏松症实验模型，与对照相比Mettl3过表达增加了卵巢切除术后小鼠成骨细胞数量，但不影响破骨细胞活性。H&E染色和组织形态学分析显示，去卵巢的对照组小鼠骨髓脂肪细胞过度积累，而去卵巢的Mettl3敲入小鼠骨髓脂肪细胞的增加较小。
4. m6A调控甲状旁腺激素受体-1（Pth1r）的翻译
通过m6A MeRIP-seq技术对MSCs中m6A具体情况进行分析，结果显示m6A峰主要位于CDS和3’UTR区，并且主要位于终止密码子附近。还发现Pth1r是MSCs和成骨细胞前体中谱系分配的关键调控因子，在其翻译终止密码子附近具有高富集和特异性的m6A峰。RNA-seq发现Mettl3缺失的MSCs存在甲状旁腺激素（PTH）调控基因表达的全局下调，提示PTH/Pth1r信号轴可能是Mettl3介导的m6A甲基化对MSCs命运的影响通路。
通过m6A MeRIP-seq技术对MSCs中m6A具体情况进行分析，结果显示m6A峰主要位于CDS和3’UTR区，并且主要位于终止密码子附近。还发现Pth1r是MSCs和成骨细胞前体中谱系分配的关键调控因子，在其翻译终止密码子附近具有高富集和特异性的m6A峰。RNA-seq发现Mettl3缺失的MSCs存在甲状旁腺激素（PTH）调控基因表达的全局下调，提示PTH/Pth1r信号轴可能是Mettl3介导的m6A甲基化对MSCs命运的影响通路。
5. m6A对于PTH功能是必不可少的
Mettl3敲除的小鼠经PTH处理后骨重塑未见明显增强，证实敲除Mettl3可减弱PTH诱导的成骨作用。PTH除了在成骨过程中显著富集外，还能抑制脂肪细胞分化，促进骨形成。PTH间歇性注射显著降低了Mettl3敲除小鼠体内MAT的积累，但很难逆转Mettl3缺失小鼠中较高的骨髓脂肪含量；Pth1r过表达改善了m6A还原引起的油红O染色强度增加，显著提高ALP活性和钙结节形成。Pth1r的过表达可以在很大程度上逆转MSCs向脂肪细胞的倾斜分化，改善成骨，进一步证实了PTH/Pth1r信号通路是mettl3介导的m6A修饰控制MSCs谱系分配的新机制。
Mettl3敲除的小鼠经PTH处理后骨重塑未见明显增强，证实敲除Mettl3可减弱PTH诱导的成骨作用。PTH除了在成骨过程中显著富集外，还能抑制脂肪细胞分化，促进骨形成。PTH间歇性注射显著降低了Mettl3敲除小鼠体内MAT的积累，但很难逆转Mettl3缺失小鼠中较高的骨髓脂肪含量；Pth1r过表达改善了m6A还原引起的油红O染色强度增加，显著提高ALP活性和钙结节形成。Pth1r的过表达可以在很大程度上逆转MSCs向脂肪细胞的倾斜分化，改善成骨，进一步证实了PTH/Pth1r信号通路是mettl3介导的m6A修饰控制MSCs谱系分配的新机制。
总结
Mettl3介导的真核生物m6A RNA甲基化修饰对稳定体内稳态具有广泛的功能影响，而m6A水平的任何扰动都可能导致功能障碍或疾病。在这里研究证实了骨髓间充质干细胞中Mettl3的缺失破坏了小鼠的细胞命运，导致骨质疏松症病理表型如成骨潜能不全的骨量减少、成骨潜能增强的骨髓脂肪增多等，揭示了m6A对骨髓间充质干细胞的有效特异性调控。此外，Mettl3功能的增加可以预防雌激素不足引起的绝经后骨质疏松症，确立了Mettl3在确定骨髓MSC命运中不可或缺的作用，从而保证骨骼健康。早期骨髓间充质干细胞中m6A表观遗传修饰的减少抑制哺乳动物Pth1r的翻译，并在骨积累过程中阻断其对PTH的合成反应。这些功能缺陷使MSC微妙的分化平衡向脂肪谱系倾斜，导致严重的骨质流失和过度的MAT堆积。实验数据丰富了m6A调控干细胞分化的证据，揭示了调控不当的m6A修饰与骨病理障碍之间的功能联系，从而为骨质疏松症治疗新策略的开发提供了可能。
全文链接
https://www.nature.com/articles/s41467-018-06898-4
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