近日，云序生物联合南京医科大学第一附属医院的束永前团队将最新的研究成果，以题为「Upregulation of the long noncoding RNA FOXD2-AS1 promotes carcinogenesis by epigenetically silencing EphB3 through EZH2 and LSD1, and predicts poor prognosis in gastric cancer」发表于著名学术期刊《Oncogene》（影响因子：6.854）。该研究发现了促进胃癌进展的重要 lncRNA FOXD2-AS1，并且揭示 FOXD2-AS1 通过 EZH2 和 LSD1 与目标基因结合而诱导转录沉默的新机制。FOXD-AS1 通过 EZH2 和 LSD1 介导 EphB3 下调促进胃癌发生。这些结果表明在胃癌发生过程中 FOXD2-AS1 可以通过与 EZH2 和 LSD1 发生直接相互作用抑制 EphB3 发挥肿瘤诱导因子的作用，因此该分子或可成为检测癌症发生的新标志物。
 

 

研究背景：

Long noncoding RNAs (lncRNAs) 是一组无蛋白编码潜能，大小超过 200 个核苷酸的非编码 RNA。许多研究表明，lncRNA 在不同的分子通路中发挥关键的调节作用，特异性的 lncRNA 与肿瘤的发生有关，例如 FENDRR、TINCR 和 GAPLINC，并且在胃癌细胞中 lncRNA 异常富集。数据显示，多种肿瘤相关的 lncRNA 通过与甲基转移酶 EZH2 和去甲基化酶 LSD1 相互作用调节癌症进展。

胃癌（GC）是世界上排名第四的恶性肿瘤，在东亚地区发病率较高，大多数病例由于早期无特定的症状而被诊断为晚期。此外，由于对胃癌发生的分子和遗传机制知之甚少，治疗方案也很有限。认识到遗传和表观遗传失调与肿瘤发生有关，识别新的诊断和预后生物标志物，对预测胃癌的发生具有很好的应用前景。

研究思路：

此次云序生物和南京医科大的研究团队对 FOXD2-AS1 在胃癌进展中发挥的功能以及调控的相关生物学机制进行了深入研究，其思路和方法值得我们借鉴。本研究中，首先比较了 GEO 数据库中 GC 和正常胃组织的 lncRNA 表达谱，发现了一种新的 lncRNA FOXD2-AS1 在 GC 中显著过表达。深入分析发现 FOXD2-AS1 在 GC 中的上调与肿瘤大小、癌症发展阶段以及不良预后存在正相关关系。RACE 分析和 Sanger 测序表明，该转录本增加了两个外显子。GO 和 GSEA 分析显示其与细胞周期和 DNA 复制显著相关，FOXD2-AS1 的敲除和过表达进一步验证了生信分析结果。RIP 和 RNA pull down 结果表明 FOXD2-AS1 与 EZH2 和 LSD1 蛋白结合。WB 结合 IHC 证实了 FOXD2-AS1 与 EphB3 的相关性，并且利用 ChIP、qChIP 和 ChIRP 技术结合流式细胞术以及生信分析的手段，证明 FOXD2-AS1 通过将 EZH2 和 LSD1 引入到 EphB3 的启动子中，抑制其转录。至此，成功揭示了 FOXD2-AS1 通过 EZH2 和 LSD1 介导的 EphB3 下调促进胃癌发生的新机制。

 

图 1. 技术路线图

研究内容：

1. LncRNA 在 GC 中的表达谱

研究者利用现有芯片数据分析 26 对癌症和非癌组织发现 lncRNAs 中 41 个表达上调，71 个表达下调，其中 H19，UCA1，PVT1 和 FOXD2-AS1 在胃癌中上调显著。为了评价 lncRNA 在 GC 中的作用，我们选择了 FOXD2-AS1，显著 P-Values 和 False discovery rate (FDR) 分析表明 FOXD2-AS1 在 GC 组织中上调最为显著。RACE 分析和 Sanger 测序揭示其全聚（A）阳性序列和基因大小（3057bp）。UCSC 和 CPC 分析证实 FOXD2-AS1 没有蛋白编码能力。检测 106 例受试者中 FOXD2-AS1 的表达水平，对比癌组织/癌旁组织（T/N）比值，结果显示 FOXD2-AS1 在 GC 组织中的表达量约 70%。RT-qPCR 验证发现多种胃癌组织中 FOXD2-AS1 富集显著增加。并且 FOXD2-AS1 的表达水平与肿瘤大小、浸润性及肿瘤阶段呈正相关。
 

图 2. GC 中 lncRNA 表达谱分析

 

2. GC 细胞中 FOXD2-AS1 富集高的患者预后较差

在芯片数据 GSE51575 基础上，以正常组织作为对照，来评估 FOXD2-AS1 的诊断效果。ROC 曲线下面积为 0.919（95% 置信区间 [CI] 0.809-0.976；P < 0.0001）; 特异性和敏感性分别为 0.885 和 0.885。此外，发现区分肿瘤组织的临界值为 10.925（△Ct）和 AUC 为 0.709（95% CI 0.643 -0.769；P < 0.0001），特异性和敏感性分别为 0.726 和 0.632。利用 Kaplan-Meier (K-M) 曲线和 log-rank 方法分析 FOXD2-AS1 富集与无病生存 (DFS) 之间的相关性，发现高富集 FOXD2-AS1 的患者比低富集 FOXD2-AS1 的患者预后差。
 

图 3. FOXD2-AS1 与 GC 患者预后关系

3. FOXD2-AS1 是体外和体内的肿瘤诱导因子

为了评估 FOXD2-AS1 是否能促进 GC 进展，基于芯片数据 GSE51575 进行 GSEA 分析，结果显示，细胞周期和 DNA 复制两个增殖指标与高 FOXD2-AS1 表达组和低 FOXD2-AS1 表达组的基因特征最为相关。GO 分析揭示了在 FOXD2- AS1 敲除的细胞中与细胞周期和 DNA 复制相关的基因的变化。此外，采用 qPCR 和 WB 检测发现 FOXD2-AS1 富集变化显著改变了肿瘤发生的关键基因的特征，提示 FOXD2-AS1 可能是胃肿瘤发生的关键调控因子。采用基因沉默和过表达的方法，揭示在裸鼠中 FOXD2-AS1 功能缺失能够抑制胃癌细胞的细胞周期进程，而 FOXD2-AS1 的表达上调能够促进癌症进展。
 

图 4. FOXD2-AS1 对 GC 进展的影响

 

4. FOXD2-AS1 通过与 EZH2、LSD1 相互作用改变 EphB3 表达

既往研究表明，lncRNA 通过 RNA 结合蛋白调控下游因子，是否 FOXD2-AS1 介导的调控同样通过类似的机制发生，研究者利用生物信息学方法结合 RIP 测序、RNA pull down 技术最终验证了 FOXD2-AS1 通过与甲基转移酶 EZH2 和去甲基化酶 LSD1 的结合在 GC 细胞中发挥重要的调控作用。从 RNA 测序数据来看，FOXD2-AS1 减少时，EphB3 表达增加。敲除 FOXD2-AS2 后，发现 EphB3 表达显著增加，而异位 FOXD2-AS1 表达降低了 EphB3 mRNA 的富集。WB 证实了 FOXD2-AS1 的敲除和过表达在 GC 细胞中分表上调和下调了 EphB3 的水平。为了确定 FOXD2- AS1 是否通过将 EZH2 和 LSD1 招募到 GC 中的 EphB3 启动子区来抑制转录，这里进行了功能的敲除和回补实验以及 ChIP 检测，发现 EZH2 和 LSD1 沉默后，EphB3 上调。FOXD2-AS1 的敲除降低了 GC 细胞的结合能力和诱导的修饰，而对照细胞则通过重组 shRNA 进行转染。为了观察 FOXD2-AS1 是否直接作用于靶色素，我们利用 ChIRP 方法分离染色质，分析了 FOXD2-AS1 依赖的 EZH2/LSD1 靶基因 EphB3 的位点，并使用 qPCR 检测。ChIRP 结果显示 FOXD2-AS1 被招募到 GC 细胞的 EphB3 启动子中。最后，在 GC 组织中评估 EphB3 表达，与 FOXD2-AS1 呈反比关系，同时，FOXD2-AS1 过表达导致的 EphB3 沉默被同时 EZH2 或 LSD1 敲除逆转。这些结果表明 FOXD2-AS1 可以将 EZH2 和 LSD1 引入到 EphB3 启动子中，抑制其转录。
 

图 5. FOXD2-AS1 通过与 EZH2、LSD1 相互作用改变 EphB3 表达

5. 促 EphB3 表达可抑制 GC 细胞增殖

数据显示，相对于正常组织，GC 组织中对 EphB3 的富集显著降低，低的 EphB3 表达表明疾病进展。此外，将 FOXD2-AS1 与 EphB3 表达结合，可获得较好的预后价值。使用 IHC 对 106 个匹配的 GC 及周围正常组织的 EphB3 蛋白水平进行了评估，发现在约 80% 的非瘤性胃组织中，EphB3 信号呈阳性，且这些肿瘤组织与周围正常组织相比，大多表现出较低的 EphB3 蛋白表达。此外，EphB3 蛋白表达水平越低，疾病阶段越晚期。上述结果表明，低 EphB3 表达与 GC 进展有关。EphB3 转染实验显示 EphB3 与 FOXD2-AS1 诱导的 GC 细胞增殖有关。拯救实验验证了 FOXD2-AS1 通过阻断 EphB3 表达来调控 GC 细胞生长。
 

图 6. 促 EphB3 表达可抑制 GC 细胞增殖

 

总结：

云序生物&南京医科大共同发表的这篇研究成果，为胃癌发生的机制提供了全新的认识。文章揭示 FOXD2-AS1 可能是胃癌关键的肿瘤促进基因，并有可能成为胃癌潜在的生物标志物和治疗靶点。回顾全文，从实验设计、开展，再到数据的分析，每一个思路每一个方法都值得我们学习和借鉴，正确的选择是成功的一半，这些都离不开云序生物强大的科研团队所做出的贡献。

全文信息：
Tong-peng Xu, et al. Upregulation of the long noncoding RNA FOXD2-AS1 promotes carcinogenesis by epigenetically silencing EphB3 through EZH2 and LSD1, and predicts poor prognosis in gastric cancer. Oncogene (2018), http://sci-hub.tw/10.1038/s41388-018-0308-y

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