RNA甲基化领域是当前最耀眼的国际科研明星，也是国自然申请的大热点；究其原因，是因为最近一两年，RNA甲基化的功能与分子机制方面取得了巨大的进展。RNA甲基化已被证实在癌症发生发展，病毒感染，神经发育，干细胞分化等过程中发挥着关键作用。今天，我们承接上一期的癌症篇，为您带来病毒领域的RNA甲基化研究进展。

 

1.Nature Immunology：DDX46影响抗病毒RNA的去m6A甲基化，抑制细胞的抗病毒免疫应答

影响因子：21.5，2017.8.28 

中国医学科学院联合上海第二军医大学团队证实RNA解旋酶DDX46通过RNA去甲基化修饰，抑制水泡型口炎病毒（VSV）的天然免疫应答。那为什么作者会锁定DDX46来做研究呢？因为大多数DDX家族成员参与mRNA剪接，其中有三个成员（DDX1，DDX3和DDX41）作为胞质感受器还参与了抗病毒的天然免疫反应。于是，作者希望能够找到其它参与mRNA剪接且在核内影响宿主抗病毒反应的DDX家族成员。作者将DDX家族的7个成员（DDX5，17，23，39，42，46和48）作为候选，应用siRNA敲低其表达，发现只有敲低DDX46表达才能显著增加VSV病毒感染后干扰素的产生。为进一步揭示DDX46功能，作者应用CLIP测序，发现DDX46与抗病毒基因（Mavs，Traf3和Traf6）通过与共有保守结构域CCGGUU结合而起作用。在分子机制上，作者以去甲基化酶ALKBH5为研究对象，应用RIP测序，发现感染病毒后细胞核内DDX46与ALKBH5结合显著增加，使得与DDX46结合的抗病毒效应分子mRNA发生去甲基化修饰，导致复合物在核内滞留，抑制了抗病毒效应分子蛋白的表达，从而降低干扰素产生，最终抑制抗病毒天然免疫应答反应。

图1. RIP测序检测感染DDX46与ALKBH5结合的增加

2. Nature Microbiology：HIV病毒感染促进自身及宿主淋巴细胞的m6A RNA甲基化      
2016.2.22

同样来自Nature的子刊，加州大学圣地亚哥医学院Tariq团队利用HIV感染CD4淋巴细胞（该细胞为艾滋病病毒的主要攻击对象），在病毒感染增殖期（感染后第3天）取样进行实验。作者应用m6A RNA甲基化测序和northern blot技术结合， 证实HIV-1病毒感染淋巴细胞后，不管是病毒自身的RNA，还是宿主细胞的RNA，能促进RNA的甲基化反应。研究团队应shRNA，在CD4 T淋巴细胞敲低m6A甲基转移酶METTL3和METTL14，发现HIV-1的复制受到抑制，在敲低甲基转移酶ALKBH5，发现促进了HIV的复制。作者通过m6A RNA甲基化测序，检测到HIV RNA上有14个m6A甲基化peak，接着再应用m6A RNA甲基化测序，在受感染CD4 T淋巴细胞中筛选到56个因m6A甲基化修饰而差异表达的转录因子，GO分析表明这些转录因子和病毒基因的表达调控有密切关系。为了进一步研究病毒RNA甲基化位点功能，作者在第11个peak的茎环结构IIB区将A7877和A7883位点做甲基化处理，发现人类和病毒RNA中m6A修饰促进Rev蛋白和RRE RNA的结合，从而调控RNA出核。

图2. HIV-1病毒感染CD4 T淋巴细胞后m6A修饰的作用机制 

3. Cell Host & Microbe：m6A RNA甲基化修饰调控黄病毒感染

影响因子：14.9，2016.11.9

杜克大学医学院Stacy研究团队研究了m6A RNA甲基化修饰对丙型肝炎病毒（HCV）感染的影响。他们发现，在Huh7细胞内利用siRNA敲低甲基转移酶METTL3和METTL14后，HCV的非结构蛋白NS5A的表达明显升高，当敲低去甲基化酶FTO后，NS5A蛋白表达明显降低。由于NS5A蛋白与HCV的复制密切相关，以上研究表明m6A相关的酶系统调控HCV感染。研究人员还发现，YTHDF蛋白可以识别HCV RNA，并负调控HCV子代病毒的产生。由于HCV病毒的复制主要位于细胞内的脂质体内，他们利用免疫荧光技术对HCV感染的细胞内的YTHDF蛋白进行了定位，发现HCV感染诱导YTHDF蛋白向脂质体的定位，识别并结合HCV RNA，还在其他黄病毒属病毒包括登革病毒（DENV2）、黄病毒（YFV）、寨卡病毒（ZIKV）和西尼罗病毒（WNV）中也应用m6A RNA甲基化测序检测到m6A修饰位点。综上，本研究发现细胞质内复制的HCV病毒存在m6A修饰，在病毒的生命周期内扮演重要角色，这也为黄病毒属疫苗的研究提供了新的切入点。

 

图3.黄病毒属病毒m6A RNA修饰调控病毒感染机制 

4.Cell Host Microbe：寨卡病毒感染过程中病毒及宿主的m6A RNA甲基化修饰的动态变化

影响因子：14.9，2016.11.9

加州圣地亚哥大学学者发现m6A甲基化不但影响寨卡病毒自身的转录，还影响宿主RNA的结构和功能，并阐明了相关作用机制。作者首先应用m6A RNA甲基化测序，检测到m6A在寨卡病毒中高表达。接着，在293T细胞内利用shRNA敲低甲基转移酶METTL3和METTL14以及去甲基化酶ALKBH5和FTO后，应用RIP测序和Real-time PCR结合，检测寨卡病毒体内RNA表达量，以上研究表明m6A相关酶系统调控m6A的甲基化与去甲基化，从而负调控病毒的复制。作者应用敲降技术，敲低YTHDF1-3蛋白的表达，发现任意单独敲除一种蛋白后，都可促进寨卡病毒的复制，并且敲低YTHDF 2蛋白后，对病毒复制的促进作用最强。为验证敲降结果，作者构建YTHDF1-3蛋白与pcDNA的重组质粒，分别转染至293T细胞，发现病毒的复制受到抑制，并且YTHDF 2的抑制作用最强。敲降和过表实验共同说明，YTHGF 1-3参与了寨卡病毒感染的过程，并且YTHGF 2蛋白作用最显著。为进一步研究YTHGF 2蛋白作用机制，作者应用WB技术，检测到YTHGF 2在敲低METTL14或ALKBH5的细胞中高表达，并应用RT-qPCR技术，检测到敲低ALKBH5后，能显著促进病毒复制，而METTL14抑制病毒复制，说明ALKBH5通过直接结合YTHGF 2，参与病毒复制过程。总体来说，本研究揭示了受寨卡病毒感染宿主细胞内m6A相关酶的作用机制。

 

图4.宿主体内寨卡病毒的作用机制 

5. eLIFE：m6A RNA甲基化调控HIV-1病毒感染和Gag蛋白表达

影响因子：7.7，2016.7.2

与加州大学一样，来自俄亥俄州立大学团队也研究了HIV-1 RNA m6A修饰与病毒感染和基因表达的关系。作者应用RIP测序和m6A RNA甲基化测序，发现HIV-1感染CD4 Jurkat细胞，CD4 T淋巴细胞或293T细胞后，发现m6A在细胞间的修饰位置相似，主要分布在基因组非编码区。接着，作者应用CLIP和m6A RNA甲基化测序，检测过表达HIV-1病毒后，Hela或CD4细胞中YTHDF1-3蛋白的表达量，旨在检测YTHDF蛋白是否能与病毒的m6A位点结合。结果发现三种YTHDF蛋白都可识别并结合HIV-1 RNA中的m6A修饰位点。那么既然蛋白和位点是能够结合的，那么它们之间是在何处，在何时，又发挥着何种功能呢？作者接着在人类癌症细胞系中应用过表达和敲降技术做功能验证，证实YTHDF蛋白在HIV-1病毒复制过程中发挥负调控作用。并且，抑制蛋白表达后，病毒Gag蛋白的表达明显抑制，而通过敲降去甲基化酶AlkBH5，FTO或共抑制后，病毒Gag蛋白的表达明显升高。

图5. YTHDF蛋白负调控HIV-1病毒表达 

6. PLoS Pathogens：m6A RNA甲基化影响不同类型细胞感染Kaposi肉瘤病毒后的调控模式

影响因子：6.6，2018.4.16

伯克利大学Britta团队首次揭示了感染Kaposi肉瘤病毒（KSHV）后，细胞中m6A的分布情况，发现YTHDF2蛋白在核内发挥作用。作者应用超高液相色谱法，发现受KSHV病毒感染的iSLK 219细胞（是研究病毒裂解细胞的模式细胞），其RNA m6A甲基化位点修饰比对照组高3倍，说明病毒感染细胞可促进m6A甲基化的修饰。作者通过m6A RNA甲基化测序研究病毒裂解宿主细胞期间细胞RNA中m6A的表达量，发现m6A甲基化程度与细胞裂解程度呈成反比。为验证m6A RNA甲基化测序结果，作者应用RIP测序和Real-time PCR技术检测一条与抗病毒相关通路上6个基因的结合和表达量，发现该通路的确参与了KSHV病毒的表达，与m6A RNA甲基化转录组功能预测的结果一致。作者假设m6A在KSHV病毒生命周期中起关键作用。通过siRNA敲低iSLK 219和iSLK BAC 16细胞中METTL3或YTHDF1-3蛋白的表达，使分别其感染正常293T细胞，发现病毒的复制受抑制，并且病毒裂解反式激活因子ORF50也受到了抑制。通过对比两种细胞的m6A分布，作者发现在iSLK 219细胞中，m6A主要调控前病毒模式，而在iSLK BAC 16细胞中，m6A主要调控后病毒模式。综上，本研究证实了m6A参与了病毒感染的通路，并且在不同的细胞类型中差异很大。

图6. KSHV病毒感染iSLK 219细胞检测m6A RNA修饰实验步骤

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