环状RNA结合功能蛋白！找对方向20分文章水到渠成—云序生物
发布时间：2018-11-12 11:27 | 点击次数：
环状RNA作为研究持续火热的明星分子，不同于对其丰富的表达谱研究，环状RNA功能机制研究还仅仅处在起步阶段。环状RNA研究多为miRNA海绵机制，部分circRNA可竞争性结合miRNA，解除miRNA对靶基因的抑制作用，上调靶基因的表达。其实，环状RNA可以通过结合不同种类的功能蛋白，分别在转录前、后及翻译水平严格调控细胞生殖生长等过程。云序曾对环状RNA经典研究思路进行过详细解析（2018国自然研究热点—环状RNA研究深度剖析），感兴趣的老师可以查询浏览。4月3日，知名免疫学杂志Immunity（IF：22.845）在线发表了中科院生物物理所范祖森教授与王硕研究员为共同通讯作者的文章，介绍发现环状RNA Cia-cGAS定位于细胞核，可结合DNA敏感的cGAMP合酶cGAS并抑制其活性，调控长效造血干细胞（LT-HSC）静息状态。本文极大拓展了核内环状RNA通过结合激酶发挥重要生理功能的研究思路。
研究背景：
造血干细胞（HSC）自我更新和分化之间的平衡打破将导致骨髓衰竭及恶性血液肿瘤发生。然而，HSCs如何维持其静止状态并避免I型干扰素（IFN）介导能量耗竭、细胞凋亡仍未可知。本文一种名为cia-cGAS的环状RNA，它在长效（LT）-HSCs细胞核中高度表达。小鼠Cia-cGAS缺陷将导致I型IFN在骨髓中高表达并伴随静息LT-HSC数量显著减少。在稳态条件下，cia-cGAS在细胞核中通过结合DNA传感器cGAS以阻断其合酶活性，由此保护静息LT-HSC免于被cGAS介导耗尽凋亡。此外，cia-cGAS与线性cGAS相比，与cGAS结合亲和力更强，由此抑制cGAS介导LT-HSCs中I型IFN产生。本文揭示了一个新型环状RNA——cia-cGAS可结合DNA敏感的cGAMP合酶cGAS并抑制其活性，调控长效造血干细胞（LT-HSC）静息状态。
研究思路：
本文首先基于高通量手段比较了小鼠中LT-HSC，ST-HSC和MPPs中全转录组变化，共发现156种显著性差异表达的circRNAs。表达量验证证实9个circRNA在LT-HSC中显著性上调。在细胞表型层面，发现只有干扰D430042O09Rik转录的circRNA——Cia-cGAS后，可明显改变造血干细胞的亚群分布，作者因此锚定Cia-cGAS进行机制分析。作者通过Cas-9基因敲除策略成功构建了Cia-cGAS基因敲除小鼠，在Cia-cGAS基因敲除小鼠中LT-HSC显著性减少，I型IFN表达升高。通过RNA Pull-down实验，作者发现Cia-cGAS可以与cGAS结合，cGAS-RIP实验反向证实二者之间具有直接的相互作用。后续，作者通过生信预测结合EMSA实验分析了Cia-cGAS与cGAS相互作用的位点信息。酶学研究证明，Cia-cGAS可通过结合cGAS并抑制其活性。
研究一：环状RNA分子筛选及验证
为探索造血干细胞功能相关的circRNA分子，作者比较了小鼠不同造血干细胞（LT-HSC，ST-HSC和MPPs）中全转录组变化情况，找出了156种显著性差异表达的circRNA分子，其中49种在LT-HSC中高表达。RNase R及qPCR实验证实其中9种为真实LT-HSC中高表达环状RNA 分子。为有效筛选造血干细胞相关的circRNA分子，作者通过体内circRNA干扰实验，发现只有干扰Cia-cGAS后才能明显影响小鼠体内造血干细胞亚群分布，并表现为LSK祖细胞数量显著性增加，与此同时LT-HSC细胞数量显著减少。因此，作者结合转录组数据以及体内、体外验证实验，最终锚定Cia-cGAS分子进行后续分子机制研究。
研究二：环状RNA分子细胞表型
作者发现Cia-cGAS是由D430042O09Rik (chr7: 125776974–125784712)的4、5、6号外显子连接成环。且位于外显子上下游的内含子区域具有成环所需高度同源序列。作者通过Cas9技术手段，敲除一端同源序列后，成功获得Cia-cGAS 敲除小鼠模型。敲除小鼠中LSK祖细胞显著增多，LT-HSC显著减少，且基因敲除小鼠出生6个月后会死于贫血。对基因敲除小鼠中LT-HSC进行BrdU染色，结果说明敲除小鼠中LT-HSC细胞处于增殖分裂活跃期。同时脉冲标记H2B-GFP小鼠模型证实Cia-cGAS敲除后，静息状态的LT-HSC细胞比例显著性降低。
研究三：环状RNA分子功能机制
在确定Cia-cGAS具有明显细胞表型之后，作者围绕其分子机制展开了详细的探索。为了找到Cia-cGAS影响下游的靶基因，作者在敲除Cia-cGAS后进行转录组分析，发现差异表达的基因与IFN-α下游靶基因是一致的。且当Cia-cGAS敲除后I型IFN mRNAs 表达量也显著性增高。最终，作者证实cia-cGAS通过调控I型IFN通路影响LT-HSC静息状态。接下来，作者针对Cia-cGAS在该通路中的作用机理进行了详细解析。作者直接采用RNA Pull Down技术手段找到与Cia-cGAS相互作用的功能蛋白。基于这一技术手段，作者发现Cia-cGAS与cGAS蛋白具有明显相互作用。cGAS RIP实验反向证实二者之间具有真实的相互作用。免疫荧光及FISH实验证实Cia-cGAS及cGAS细胞内共定位表达。基于EMSA等技术手段，作者找到了二者相互作用位点。后续作者补充大量生理生化实验，最终揭示LT-HSC中Cia-cGAS结合并抑制cGAS的活性，最终通过拮抗cGAS催化产物I型IFN来维持HSCs静息状态。
总结：
本文从环状RNA结合功能蛋白角度，成功的向我们展示了核内circRNA具有重要生理功能，以及该类型circRNA的研究方法。首先通过高通量测序筛选与造血干细胞干性维持相关的circRNA分子，围绕该分子设计一系列体内、体外干扰实验，确定其可引起干细胞干性维持相关细胞表型改变。后续，与circRNA 海绵机制研究类似，RNA Pull Down实验及RIP实验成为机制研究成功与否的关键钥匙。作者基于RNA Pull-down技术筛选到可能与Cia-cGAS相互作用的蛋白质，并进一步通过RIP实验反向验证。在补充大量生理生化实验后，作者向我们完整的描绘了Cia-cGAS如何维持HSCs静息状态。本文给我们提供了很好的范本，当我们筛选到的环状RNA定位于核内，或者不能与AGO2蛋白结合，不适合进行海绵机制研究时，我们可采取的研究策略。
云序专注于环状RNA研究，前期环状RNA筛选，云序提供全转录组及环状RNA测序相关服务；环状RNA验证，云序提供qPCR，RNaseR及Sanger测序等服务；文中环状RNA机制研究金钥匙——环状RNA Pull Down及RIP 环状RNA测序，云序均可提供全套服务！新年伊始，云序客户更是在环状RNA领域接连发表高分文章，包括世界首篇小鼠大脑创伤外泌体环状RNA文章；世界首篇非洲爪蟾环状RNA研究以及世界首篇红斑狼疮性肾炎环状RNA文章等等。云序致力于帮助客户在环状RNA研究领域占得先机，拔得头筹！
作者简介：
范祖森，二级研究员，现任中科院感染与免疫重点实验室副主任，国科大微免教研室副主任，中国科学院特聘核心骨干研究员,国科大岗位教授（A类）。范祖森1998年获上海交通大学医学院免疫学博士学位，随后到哈佛大学医学院从事博士后研究，于2003年晋升为哈佛大学讲师。2004年作为中国科学院“百人计划”研究员回到生物物理所工作，2005年获“杰出青年”基金资助，2006年入选“新世纪百千万人才工程”国家级人才。2010年享受“国务院特殊津贴”专家。2014年获得谈家桢生命科学创新奖，2016年评为中科院优秀研究生导师。课题组长期从事天然免疫抗感染应答调控、肿瘤干细胞和肿瘤免疫治疗等研究，在天然免疫细胞新亚群发现、天然免疫抗感染识别机制、肿瘤干细胞自我更新机制等方面，取得了一系列有国际影响力的原创性成果。以第一及通讯作者在Cell（2篇）、Nat Immunol（5篇）、Immunity（2篇）、Cell Stem Cell（2篇）、JEM（3篇）、JCI、NSMB、Nat Commun（8篇）、 EMBO J（2篇）、Blood等国际权威学术期刊发表SCI高水平研究论文70余篇，研究处于国际前沿。课题组经过多年的研究积累业已形成优秀的免疫学研究平台和优良的科研文化氛围，在天然免疫抗感染应答与肿瘤免疫领域培养出一支优秀的科研团队。已培养了30余位博士毕业生和近10位博士后，10余人获得中科院院长特别奖、优秀奖及优秀博士论文，有近10人晋升为教授岗位（包括北大、清华教授），3人获得中组部“青年千人”计划，1人获得基金委“优青”等。
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