作为最新的明星分子，环状RNA的热度与日俱增。环状RNA到底火到了什么程度？从云序客户捷报频传﹑研究成果不断就可见一斑：上期我们刚刚介绍云序客户发表了世界小鼠脑创伤模型外泌体环状RNA的研究，整合了外泌体和环状RNA两大科研热点。在探索新物种的环状RNA研究上，云序客户此前更是先后发表了全世界第一篇斑马鱼环状RNA、第一篇小麦环状RNA和第一篇鸡环状RNA文章，如今首篇非洲爪蟾的环状RNA文章新鲜出炉了！这一成果今年年初发表在《Chemosphere》（影响因子4.2）上！

研究背景：

利用高通量测序手段，研究者们在拟南芥、小鼠、果蝇和人体内都发现了环状RNA的高度表达，证明了环状RNA在不同物种中广泛存在。目前，已经进行过环状RNA研究的物种数量还非常有限，环状RNA数据库circBase中已收录的物种仅有7个。作为一种重要的模式生物，非洲爪蟾的环状RNA尚未见报道。本文通过云序生物提供的一站式环状RNA测序、环状RNA定量PCR、环状RNA的RNase R耐受性实验和生物信息学服务于全世界首次进行了非洲爪蟾环状RNA表达谱的构建，为后续研究脊椎动物环状RNA的生物学功能奠定了基础，非常具有借鉴意义。

研究思路：

作者首先分离了采用除草剂处理的雄性非洲爪蟾的睾丸组织，提取RNA，通过全转录组测序检测样本中环状RNA的表达变化。结果发现405个差异表达的环状RNA，其中44条上调和361条下调，这暗示着这些环状RNA可能在AZ污染过程中发挥作用。接下来通过环状RNA定量PCR检测和RNase R耐受性实验验证了环状RNA的表达量和结构。随后通过生信分析如GO及KEGG分析对差异表达的环状RNA进行了功能预测。GO分析表明这些RNA分子主要参与19条信号通路，其中Wnt信号通路介导的卵母细胞成熟通路可能是AZ污染涉及的信号通路。CircRNA-miRNA互作网络图揭示了环状RNA作用靶miRNA及可能的功能。本文首次研究了非洲爪蟾的环状RNA表达谱，为后续分子机理详细研究提供诸多靶分子。

研究路线图：

1.环状RNA测序，高通量筛选AZ处理相关环状RNA

各类农药(除草剂、杀虫剂和杀菌剂三类)对非洲爪蟾产生的包括神经发育、性腺发育和变态发育等方面的毒害作用,使得非洲爪蟾作为农药污染监测的模式生物备受青睐。莠去津（Atrazine, AZ）是地下水和地表水中最常见的环境内分泌干扰物之一。研究人员在Nieuwkoop-Faber（NF）第47阶段（孵化后第13天），将来自一对成年配偶的蝌蚪随机分为AZ处理和对照两组，随后收集雄性非洲爪蟾的睾丸组织（AZ处理组vs.对照组：3 vs.3）用于检测非洲爪蟾中所有环状RNA的表达情况，检测一共发现了68575条环状RNA。接下来，研究人员系统分析了不同样本之间环状RNA的表达情况，发现405条环状RNA差异表达（包括44条上调和361条下调），这暗示着这些环状RNA可能在AZ污染过程中发挥作用。

图注：不同样本之间差异表达的环状RNA

2. 环状RNA定量PCR及RNase R耐受实验，验证环状RNA的表达和结构

为了验证测序结果的准确性，研究人员随机选取了8条差异表达的环状RNA，利用“divergent primers”进行环状RNA定量PCR检测和RNase R耐受性实验。所有环状RNA的表达都能够被定量PCR实验检测到，并且定量PCR结果与测序结果趋势一致，表明环状RNA测序结果准确性非常高。所有环状RNA都能抵抗RNase R的消化，进一步证实了这些RNA的环形结构。

图注：差异表达环状RNA的定量PCR验证。左：引物位置图；右：RNase R耐受性实验结果

3.生物信息学分析，AZ处理相关环状RNA的功能预测

2013年两篇Nature文章揭示环状RNA具有miRNA海绵的功能，它可以吸附miRNA来调节相关基因的表达。此后，环状RNA的ceRNA功能机制正被人们广泛研究。研究人员通过生物信息学预测，发现282条AZ相关差异表达的环状RNA含有miRNA的结合位点，每个环状RNA的结合位点数从1到21不等。基于这些数据，研究人员根据它们的结合能力选出了5个miRNA。 然后他们随机选择了5个差异下调的环状RNA，并使用前5个预测的miRNA构建了circRNA-miRNA网络。可以看出每个环状RNA有多个miRNA结合位点，且一些环状RNA与同一miRNA的结合位点是相同的，暗示着环状RNA彼此之间的竞争性与miRNA结合。以上结果表明非洲爪蟾体内环状RNA可能存在的miRNA的海绵功能。

图注：依据AZ处理组5条差异下调的环状RNA建立的circRNA-miRNA网络图

 

此外研究人员在以上基础上进一步预测了这282条差异表达的环状RNA结合miRNA的靶基因功能。通过GO分析和KEGG 信号通路分析，发现这些miRNA的靶基因主要参与了19条信号通路，其中Wnt信号通路介导的卵母细胞成熟通路可能是AZ污染涉及的信号通路。

图注：差异表达的环状RNA来源基因KEGG分析

 

结语： 作为一种广泛存在于各类真核生物中的新型非编码RNA，环状RNA逐渐成为了当下最热门的明星分子。由于环状RNA的研究刚刚起步，已经进行过环状RNA研究的物种数量还非常有限。因此，对新物种中环状RNA表达谱进行系统性研究就成为了发表SCI文章的一条捷径。 云序生物客户发表的这项成果是全世界第一篇对非洲爪蟾环状RNA进行系统性研究的文章，也为广大研究人员提供了一个非常好的模板，即：如何通过环状RNA高通量测序和生物信息学分析，在不进行功能和分子机制研究的情况下，短平快的发表一篇影响因子不错的文章，非常具有借鉴意义。

参考文献：

Identification of circular RNAs and their alterations involved in developing male Xenopus laevis chronically exposed to atrazine

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