2018国自然研究热点一：环状RNA研究深度剖析--云序生物
发布时间：2018-11-05 15:45 | 点击次数：
1.环状RNA为什么火？它到底是何方神圣？
2013年两篇Nature[1][2]文章的出世，彻底颠覆了我们对RNA的传统认知，同时也迅速引爆了整个生物医学界！经过严格统计汇总后，2017年国家自然科学金获批的项目中环状RNA研究相关的项目总数高达176项，其中有两项杰出青年基金，一项优秀青年基金，两项重点项目，94项面上项目，62项青年基金项目，15项地区科学基金项目。
从获批学科方向角度分析，发现肿瘤学方向是环状RNA研究获批项目中最多的学科方向，而消化系统相关肿瘤是其中获批最多的学科单项，除此之外，循环系统的环状RNA研究也是异军突起，一跃成为第二大环状RNA研究领域。其实医学方向除了肿瘤学和循环系统以外，其他方向也都获得资助，比如中医学和药理学方向，相信未来其他类型的肿瘤和学科方向必定会争取更多的环状RNA课题资助。与此同时，生命科学方向环状RNA研究显得略微低调些，从获批的16个项目来看，基础的遗传学和生物信息学(C06)和畜牧业(C1701)相对受到更多的重视，相信如果突破相关研究领域的技术瓶颈，在生命科学方向会出现更多的环状RNA研究
从获批研究内容分析，发现与2016年相比，2017年获批的项目中，只进行环状RNA表达谱分析的课题非常少，绝大部分是针对环状RNA的功能机制展开，这表明环状RNA研究已经实现从基础筛选到特定功能机制研究的过度。值得一提的是，其中环状RNA与microRNA相互作用是目前最常见的，也是项目数占比最多的研究思路，另外外泌体来源的环状RNA项目也比较多，也是目前环状RNA的重要方向。
那么接下来，小编将从以下几个角度讲解环状RNA目前的研究思路。
环状RNA是什么？
环状RNA（circRNAs）是一类不具有5’末端帽子和3’末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。目前发现的circRNAs主要来源于基因外显子exon，但还有其他类型，比如来源于内含子intron，基因间intergenic，反义链antisense，重叠区sense overlapping。
circRNA的主要特征有哪些呢？
(1) circRNA由于反式剪切，大量存在于真核细胞的细胞质中（定位于细胞质是miRNA海绵机制研究的充分必要条件），少部分内含子来源的circRNA存在于核酸内，具有一定的组织特异性、时序和疾病特异性（灰常适合做分子标志物哦）。circRNA广泛存在于人体细胞中，有时超过其线性异构体10倍之多。
(2) 与传统线性RNA相比，circRNA分子没有5’末端帽子和3’末端poly(A)尾巴，呈封闭环状结构，不易被核酸外切酶RNaseR降解，比线性RNA更稳定。（RNaseR耐受实验，验证circRNA的环形结构）
(3) 部分circRNA含有miRNA应答元件，可充当竞争性内源RNA（ceRNA），与miRNA结合，在细胞中起到miRNA海绵作用，进而解除miRNA对靶基因的抑制作用，上调靶基因的表达水平。（具体研究见下）
(4) 可以翻译成蛋白质，但大部分是非编码RNA。（与表观结合：可通过m6A甲基化翻译蛋白质[3]）
2.环状RNA的研究思路是怎样的呢？
所谓兵马未动，粮草先行！环状RNA的研究也是一场没有硝烟的战争，须得抢占先机，方能知己知彼，百战不殆。为了各位在这场“战争”中取得胜利，云序生物为大家准备了环状RNA研究的思路宝典，如下。
从文章的工作量、难易程度及杂志发表角度看，小编把环状RNA研究思路分为表达谱分析，生物标志物，功能机制研究三大类。那么接下来小编将从这三个角度给大家详述。
不论从哪一个角度，首先需要确定好研究物种，疾病模型，样品类型等基本信息。接下来，通过高通量手段即RNA-seq（云序提供全转录组-seq或circRNA-seq）或文献报道，筛选差异表达的circRNA。如果想短平快的发表3-5分的文章，那么表达谱分析显得再合适不过了。如果有大量的临床样本，那么做分子标志物也是很easy的，思路和表达谱分析相似如下图展示，不过多了临床样本的统计和验证。（比如KM曲线，ROC曲线，PAM分析等等）
接下来，便是重头戏，circRNA功能机制研究如何进行呢？
这要看各位想从哪个角度入手了。目前circRNA研究的功能机制大致分为：miRNA海绵，与功能蛋白结合，顺势调控来源基因表达，还有就是circRNA上发生RNA甲基化可翻译蛋白质等。其中miRNA海绵是目前做的最普遍，也是目前申请的国自然里占比最多的。接下来小编会好好介绍一下这一方面的研究思路及研究方法。
miRNA海绵机制：
通过高通量测序手段得到一批数据后，很多人会犯愁到底怎么运用数据呢？想必下面这篇文章[4]大家都烂熟于心了吧？那么小编再次带大家领略一下高分环状RNA的风采。
高通量测序产生的数据，需要进一步实验手段进行验证。而在诸如Nature communication这类高分杂志中，验证工作可谓是面面俱到。不仅包括表达量验证，还包括结构验证，细胞定位及功能验证等。有的甚至还包括环状RNA形成机制的研究，在这儿不赘述。
体外差异环状RNA的验证
a表达量验证：qPCR
b结构验证：由于circRNA不易被核酸外切酶RNaseR降解，比线性RNA更稳定。可通过RNase R耐受性实验验证其环形结构。
c细胞定位：由于circRNA是在细胞质中发挥miRNA海绵机制，因此需要通过核质分离实验或FISH验证其在细胞中的定位。
d功能验证：对上述步骤筛选出的1-2条circRNA设计siRNA或者过表达质粒，通过一系列细胞表型实验，验证circRNA所发挥的细胞功能。最终挑选表型最为显著的circRNA做后续机制研究。
图示：差异circRNA验证 左：RNaseR耐受实验 右：FISH定位
图示：差异环circRNA左：敲除实验 中：细胞侵袭 右：细胞迁移实验
目标circRNA的机制研究
a RIP-qPCR：挑选功能最为明显的1个circRNA做RIP-qPCR实验，检测circRNA是否与AGO2蛋白结合。（AGO2是circRNA发挥海绵作用的指示蛋白）
b RNA pull down：对上述circRNA进行RNA pull down实验，拉下来的RNA进行定量PCR检测，检测生信预测中与该circRNA结合的10-20疾病miRNA。
c luciferase assay：根据上步结果为circRNA挑选3个左右的miRNA做后续荧光素酶实验(miRNA与circRNA表达趋势一致)，分别构建circRNA的荧光素酶载体，miRNA结合位点突变的荧光素酶载体。
将circRNA荧光素酶载体与3个miRNA mimics共转染至细胞，检测荧光活性，证明环状RNA和miRNA mimics的结合。
d miRNA功能实验：选定1个miRNA研究其对某一确定细胞表型和靶基因表达水平的影响（如：迁移）；
e 恢复性实验：分别研究：单独转染nc mimics或单独转染miRNA mimics或单独转染环状RNA过表达质粒，及共转染环状RNA+miRNA mimics对某一确定细胞表型和环状RNA表达水平的影响。
f 回补性实验：敲除circRNA后，过表达靶基因，检测靶基因是否能逆转circRNA敲除导致的表型变化。
图示：差异环状RNA左：Ago2 RIP 中：荧光素酶筛选系统 右：miRNA pull down
既然是真情回馈，那么小编在这儿就给大家透露一个更容易get的研究海绵机制的思路如下图。可以同时做一下circRNA-seq和AGO2 RIP-seq，这样重叠部分的结果便是可能发挥海绵作用的circRNA。进而通过RNA pull down-WB反向验证circRNA与AGO2的相互作用，其他功能实验与上述一致。
可如果我的circRNA不是海绵机制，咋办？别怕，小编给你出大招！
circRNA结合功能蛋白：
当你发现自己的circRNA不是发挥海绵作用的时候，是不是有种泪奔的感觉？
别怕，小编这就给你吃一颗定心丸。原来circRNA不仅可以与miRNA结合发挥海绵作用，还可以结合功能蛋白发挥作用呢！下面这篇就是很好的例子！和大家一样，这篇文章的作者也是先通过AGO2 RIP实验验证了他的circANRIL是否结合AGO2，但不幸的是，结果证实他彻底的和miRNA海绵say goodbye了，顿时小编也是捏了一把冷汗。可作者竟然奇迹般地扭转了局势，通过RNA pull down探索了circANRIL上结合的蛋白，并通过RIP反向证实了circRNA是通过与PES1蛋白结合参与了rRNA的成熟过程。想来功夫不负有心人，这篇文章也是成功地发表在Nature communication上[5]。
circRNA顺势调控来源基因表达：
这里小编给大家准备了一个被掩藏许久了的环状机制：circRNA顺势调控来源基因表达的研究思路，即通过特异的RNA-RNA互作来调控转录。
这篇文献，作者首先通过CLIP-seq（检测RNA结合蛋白下游的RNA）发现RNA聚合酶II上结合了一些circRNA。并且通过鉴定，发现是外显子与保留在外显子之间的内含子形成的环状RNA，命名为外显子-内含子circRNAs（EIciRNAs），其中显著富集的circEIF3J和circPAIP作为后续研究对象。研究这通过FISH定位发现其定位于细胞核，这提示作者可能不能走miRNA海绵的路子了。So what？
作者通过反义核苷酸技术沉默circEIF3J和circPAIP后检测来源基因表达，证实了其可调控来源基因表达。RNA-DNA共定位FISH也证实EIciRNAs与其来源基因共定位于细胞核中。此外这两个EIciRNAs与Pol II互作关系也都使作者提出一个大胆的猜想：EIciRNAs可能对其来源基因有调控作用。
带着这样的猜想，接下来作者先后通过RNA pull down（检测RNA与RNA/蛋白作用）和CHIRP（是一种检测与RNA绑定的DNA和蛋白相互作用的方法。）实验分析了与两个EIciRNAs相互作用的蛋白及RNA。结果发现EIciRNAs不仅可以与Pol II结合，还与U1A和U1C snRNP结合（它参与真核生物细胞核中RNA的加工。snRNA和许多蛋白质结合在一起成为小核核糖核蛋白(snRNP即small nuclear ribonucleoproteins)，参与信使RNApre-mRN的剪接，使后者成为成熟mRNA。），且在细胞核内互作（FISH）。CHIRP实验证实EIciRNAs同Pol II、U1 snRNP共同结合于其来源基因转录起始位点上游300bp处，并且U1 snRNP的结合是必需的[8]。
circRNA翻译蛋白质：
假如这一切都不足以吸引你的眼球，那么接下来的这个案例可能会让你“跌破眼镜”。最初我们认为circRNA属于非编码RNA，不能发挥编码蛋白质的功能，那么事实真的如此么？Cell Research[3]这篇文章便告诉你：大错特错！环状RNA没有游离的5’和3’端，因此如果可以翻译的话一定是通过不依赖于5’帽子结构的方式。根据目前报道的环状RNA翻译蛋白的调控元件包括IRES和m6A修饰两种途径。
已知一些mRNA可以不依赖于帽子结构而靠一个叫内部核糖体进入位点(IRSE)的顺式调控元件来从mRNA的中间启动翻译，作者基于这种思想，检测发现自己的环状RNA上并没有IRES，却同样可以翻译蛋白。然而一直有报道称m6A可调控翻译，但并没有系统的研究，作者大胆猜想是否环状RNA上也发生了m6A修饰，并调控蛋白翻译呢？
结果不出所料，环状RNA的翻译可被RNA甲基化酶调控。作者通过一系列实验证实YTHDF3可识别circRNA上发生的m6A修饰，并招募翻译起始因子eIF3A和eIF4G2等，起始蛋白翻译。
不仅如此，环状RNA编码的蛋白质还是有功能的呢，如下面两篇文章[6][7]。
说道翻译蛋白质的研究思路，稍微复杂一些，那么小编给大家总结一下。
1. 翻译启动元件预测分析：
IRES是internal ribosome entry site的简写，是一种具备募集核糖体并实现核糖体组装和后续阅读框翻译蛋白的RNA调控元件。
2. 阅读框预测：
阅读框是Open Reading Frame的简写，指在核酸序列中从ATG开始（RNA中是AUG），三个碱基一组，直至出现TAA，TAG或TGA（RNA中A变成U）终止密码子的序列。
3. 载体表达验证实验：
通过构建正常元件和元件突变载体，即把预测到的IRES或m6A修饰位点突变掉，看后续的翻译是否正常进行。
4. 阅读框表达验证实验：
通过在原有的阅读框前端增加标签序列，包括3×Flag等标签，验证阅读框产物在生理条件下是否可以实现。
5. 内源性翻译产物鉴定：
通过制备特异性抗体进行Western等检测实验。这部分需要进行抗体特异性证明实验，包括模拟翻译产物的过表达和敲除实验等，特异性可以通过WB和IP下来质谱鉴定。
6. 核糖体结合分析：
基于蔗糖密度梯度离心的核糖体分离技术，鉴定环状RNA上是否结合核糖体，以及结合的多少。
7. 翻译产物过表达和敲低（除）实验：
通过构建过表达或敲低/敲除体系，看不同含量的翻译产物对细胞生理指标的影响情况。
3.环状RNA项目国自然申请建议
(1) 避免单纯设计表达谱的研究内容。尽早进行表达谱分析，找到有研究价值的目标环状RNA，并开展一些简单的验证实验，最好能形成大致的功能机制研究的轮廓。
(2) 开展新颖的环状RNA研究方向。包括对尚未报道或极少报道的病理或生理模型相关的环状RNA筛选鉴定，或者机制研究方向上，比如miRNA海绵，与功能蛋白相互作用，与表观水平结合，翻译蛋白质方向等。
(3) 利用多种有效地分析环状RNA与其他分子或蛋白相互作用的研究工具。包括RIP，RNA pull-down，CLIP等实验技术，如果能得到有效数据，会在国自然科学基金申请中增色不少。
参考文献
1. Memczak S, Jens M, Elefsinioti A, et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency.[J]. Nature, 2013, 495(7441):333.
2. Hansen TB, Jensen TI, Clausen BH, et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges[J]. Nature, 2013, 495(7441):384-388.
3. Yun Y, Fan X, Mao M, et al. Extensive translation of circular RNAs driven by N6-methyladenosine[J]. Cell Research, 2017, 27(5):626.
4. Zheng Q, Bao C, Guo W, et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs[J]. Nature Communications, 2016, 7(11215):11215.
5. Holdt L M, Anika S, Kristina S, et al. Circular non-coding RNAANRILmodulates ribosomal RNA maturation and atherosclerosis in humans:[J]. Nature Communications, 2016, 7:12429.
6. Legnini I, Timoteo G D, Rossi F, et al. Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis[J]. Molecular Cell, 2017, 66(1):22.
7. Yang Y, Gao X, Zhang M, et al. Novel Role of FBXW7 Circular RNA in Repressing Glioma Tumorigenesis.[J]. Journal of the National Cancer Institute, 2018, 110(3).
8. Li Z, Huang C, Bao C, et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus.[J]. Nature Structural & Molecular Biology, 2015, 22(3):256.
参考文献：Circular RNA expression alteration in exosomes from the brain extracellular space after traumatic brain injury in mice
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