近期华人科学家辛辛那提大学陈建军教授研究了METTL14和m6A RNA甲基化修饰在正常和恶性造血过程中的重要作用，表明SPI1-METTL14-MYB/MYC信号轴在髓系分化以及白血病发生过程中的作用。该研究于2018年1月发表在干细胞顶级期刊《Cell Stem Cell》（影响因子：23.394）。

研究背景：

每一年，“Nature Methods”都会对过去一年中推动生物学发展的技术方法做出总结，并评选出当年影响力最大的技术。2016年，表观转录组分析（Epitranscriptome analysis）荣膺Nature Methods年度生命科学技术。Epitranscriptome广义的指添加到核糖核苷酸上的一切修饰，并引起机体相关表型变化的现象。其中，RNA甲基化研究是表观转录组学一面大旗，在世界引起了新的科研热潮。N6-甲基腺苷（m6A）是真核细胞信使RNA（messenger RNAs，mRNA）最常见的内部修饰方式。许多证据表明mRNA或者非编码RNA上的m6A修饰影响RNA的命运以及功能，并且在组织发育，昼夜节律，DNA损伤应答，性别决定和肿瘤发生等生理过程中都发挥重要的作用。然而，它在正常或者恶性造血过程中的功能依然不清楚，本文针对该方向展开系统的研究。

研究思路：

RNA甲基化修饰伴随系统酶系协同作用，其中包括“Writer”-负责甲基转移过程，“Eraser”-负责去甲基化过程，“Reader”-负责甲基化位点识别。RNA m6A甲基转移酶以复合物形式存在，这个复合物由METTL3/METTL14异二聚体催化核心和一个调节亚基WTAP组成。 METTL3具有活化的甲基转移酶结构域，能够催化腺苷酸（A）为m6A，METTL14特异性促进METTL3识别RNA底物。科学家研究发现METTL14作为m6A甲基转移酶复合体的重要组成部分，在正常造血干/祖细胞以及携带有t（11q23），t（15；17）或者t（8；21）急性髓系白血病细胞中有较高的表达水平，并且它在髓系分化过程中表达下调。沉默METTL14能够促进正常的HSPC和AML细胞终末髓系分化，并且能够抑制AML细胞的存活/增殖。在机制上，METTL14通过m6A修饰调节其靶基因（如：MYB，MYC）发挥致癌作用，并在蛋白质水平受SPI1的负调控。METTL14在AML疾病以及白血病干/起始细胞（leukemia stem / initiation cells， LSCs/LICs）的发展以及维持过程中必不可少。总之，该研究揭示了SPI1-METTL14-MYB / MYC信号轴在髓细胞和白血病中的作用，并强调了METTL14调控m6A修饰在正常和恶性造血中的关键作用。

研究一：METTL14在HSPC中高表达，随正常髓细胞生成下调

作者首先检测了不同小鼠骨髓细胞（BMCs）中m6A甲基转移酶及去甲基化酶的表达量，发现c-Kit- 型小鼠Mettl14及Fto表达量显著性下调。同时，c-Kit- 型小鼠mRNA修饰水平也存在显著性下降现象。进一步检测HSCs和祖细胞中的Mett14表达量，结果显示Mettl14在HSCs和Lin-Sca-1 + c-kit + （LSK） 细胞中高水平表达。确定Mettl14在定型或分化的骨髓谱系细胞中表达呈现下调趋势后，作者进行细胞表型相关实验，验证Mettl14细胞功能。通过Mettl14干扰等实验，作者发现随着Mettl14在髓细胞生成过程中下调表达，其敲低进一步显著促进了HSPC向髓样细胞的分化，这意味着METTL14在抑制正常骨髓生成中起重要作用。作者后续发现Mettl14在急性髓性白血病细胞（AMLs）中有同样的表达模式。

图示：Mettl14骨髓谱系细胞中差异表达，Mettl14敲降抑制骨髓生成过程

研究二：METTL14表达受SPI1负调控

在了解METTL14在骨髓生成过程中特异表达后，作者研究了其表达的转录调控因子。通过ChIP-Seq数据，发现造血调控因子，CEBPB, GABPA, ELF1, CEBPA以及 SPI1与METTL14上游启动子区域具有结合位点。其中除SPI1是负调控外，其它因子都呈现正调控作用。敲除SPI1后，无论AMLs或CD34+ HSPCs中METTL14 mRNA及蛋白质表达水平均上调。通过ChIP-qPCR验证SPI1与METTL14 启动子区有6个结合位点。上述实验结果证实，SPI1是METTL14负反馈调节因子。

图示：AMLs及CD34+ HSPCs中，SPI1对METTL14负调节作用

研究三：RNA-Seq结合m6A-Seq 寻找METTL14生理底物

作者结合RNA-Seq以及m6A-Seq在MM6及NB4细胞（不同AMLs）中寻找METTL14生理底物。RNA-seq显示在两个细胞系中，METTL14敲低时560个基因显著下调，而377个基因显著上调（p <0.05;倍数变化> 1.2）。基因集富集分析（GSEA）显示相对于对照细胞，造血/白血病干细胞中下调的基因主要富集MYB下调靶基因。MM6和NB4细胞m6A-seq结果中鉴定出16,675和18,831个m6A峰，其对应于8,246和9,632个转录产物。与前期研究一致，m6A峰常规Motif为GGAC序列，且甲基化峰主要位于基因启动子区域。作者结合miCLIP证实，METTL14敲低时mRNA甲基化的变化主要由内部m6A，而不是5'Cap m6Am导致。

图示：RNA-Seq及m6A-Seq数据展示，METTL14直接作用MYB及MYC基因
 

研究四：MYB 及 MYC为 METTL14靶基因

分析m6A-seq及m6A-qPCR结果，发现在METTL14敲低时，MYB和MYC的m6A修饰丰度显著降低。CLIP实验直接证实METTL14直接结合MYC及MYB转录本。并且METTL14敲除AML细胞系中，MYB及MYC的表达量显著下调控。除人源细胞系，作者还发现Mettl14敲除小鼠C-Kit+ HSPC中MYB及MYC转录本上m6A修饰减少，并且两种基因表达量均下降。荧光素酶报告实验证实，METTL14主要通过调控MYB及MYC甲基化水平，进而调控二者的表达水平。

图示：METTL14调控造血干细胞分化机理

参考文献：METTL14 Inhibits Hematopoietic Stem/Progenitor Differentiation and Promotes Leukemogenesis via mRNA m6A Modification.

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